董大鵬，安 然，劉 威

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部，吉林 長春130031)

非小細胞肺癌(NSCLC)作為較常見的肺癌，起病隱匿，通常發(fā)現(xiàn)較晚[1]。而手術(shù)根治是其主要的治療手段，但存在復(fù)發(fā)率高預(yù)后不佳等問題[2]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)新輔助化療可在一定程度上降低術(shù)后的復(fù)發(fā)率[3]，但缺乏明確指標提示何類患者受益更大。miR-21被證實在多種腫瘤中表達異常且與化療耐藥相關(guān)[4]。因此本研究擬探究血清miR-21對NSCLC新輔助化療預(yù)后的檢測價值。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

收集吉大一院二部2015年12月至2016年12月的住院患者血清標本115例，分別為非小細胞肺癌組85例，健康對照組30例，基本資料見表1。每例NSCLC患者至少經(jīng)過CT和組織病理學(xué)確診為NSCLC。NSCLC患者臨床分期為Ⅰ(14例，16.5%)、Ⅱ(50例，58.8%)、Ⅲ(21例，24.7%)，診斷依據(jù)為《原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2011年版)》。采血前未進行針對腫瘤的任何治療措施。健康對照組血清來自本醫(yī)院體檢中心。留血后離心，血清于-80℃冰箱超低溫保存。

表1 NSCLC組與正常對照組一般資料比較

1.2 治療方案

85例NSCLC患者進行手術(shù)切除治療，治療前加用GP方案新輔助化療。第1-3天給予靜脈滴注順鉑(30 mg/m2/生理鹽水500 ml)；第1至第8天給予靜脈滴注吉西他濱(1000 mg/m2/生理鹽水250 ml)，滴注時間為30 min。化療前靜脈滴注地塞米松(5 mg/250 ml生理鹽水)止吐。連續(xù)2周期42天輔助化療。術(shù)后行4個療程GP方案化療。

1.3 實驗試劑

美國Thermofisher公司 mirVanaTMPARIS Kit試劑盒、蘇州金唯智生物科技有限公司miR-21和miR-232引物、北京全式金生物技術(shù)有限公司TransScript Green miRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒。

1.4 血清RNA逆轉(zhuǎn)錄和miRNA熒光定量

術(shù)前血清microRNA提取按照mirVanaTMPARIS Kit試劑盒說明書步驟進行，提取的microRNA采用加尾法進行逆轉(zhuǎn)錄，進而進行熒光定量，具體步驟按照TransScript Green miRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix。血清中miRNA-232的Ct值NSCLC組和對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(見圖1)，故血清miRNA內(nèi)參選用miR-232。血清miRNA熒光定量數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法相對定量法，公式如下:ΔΔCtNSCLC=(CtmiR-21-CtmiR-232)NSCLC-mean(CtmiR-21-CtmiR-232)Control；ΔΔCtControl=(CtmiR-21-CtmiR-232)Control-mean(CtmiR-21-CtmiR-232)Control。

圖1 血清miR-232在NSCLC中表達水平

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

研究使用卡方檢驗(χ2)和Student T-檢驗來評估NSCLC患者和正常對照之間臨床變量的頻率(IBM SPSS Statistics，Version 21.0.Armonk，NY：IBM Corp)，P<0.05差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組和對照組血清miR-21表達量比較

通過熒光定量法測定85例NSCLC患者和30例正常對照組血清中miR-21含量，結(jié)果顯示NSCLC患者血清中miR-21的相對表達量為12.54±14.54顯著高于其在正常對照組血清中的相對表達量1.81±1.75(P<0.01)，見圖2和表2。

注：**P<0.001 與對照組相比

表2 血清miR-21在NSCLC組和對照組中的相對表達量

miR-21(2-ΔΔCt)Control1.81±1.75NSCLC12.54±14.54??P value0.00

2.2 血清miR-21診斷NSCLC的價值

為了解血清miR-21在NSCLC患者中的診斷價值，采用ROC曲線進行評價。結(jié)果見圖3和表3，miR-21對診斷NSCLC的ROC的AUC為0.854(0.785-0.922)，最佳截取值為5.766，此時血清miR-21診斷NSCLC的敏感度為60.0%，特異度100.0%。

2.3 血清miR-21與新輔助化療NSCLC患者復(fù)發(fā)的關(guān)系

為了解血清miR-21與新輔助化療NSCLC患者復(fù)發(fā)之間的關(guān)系，將1年內(nèi)復(fù)發(fā)患者、未復(fù)發(fā)患者和正常對照組血清miR-21含量進行比較。結(jié)果見圖4和表4，結(jié)果顯示復(fù)發(fā)NSCLC患者血清中miR-21的相對表達量為27.28±16.36顯著高于未復(fù)發(fā)NSCLC組和正常對照組血清中的miR-21相對表達量5.03±3.87和1.81±1.75(P<0.01)。

圖3 血清miR-21診斷NSCLC的ROC曲線

表3血清miR-21診斷NSCLC的ROC曲線線下面積和置信區(qū)間

AUC95%CImiR-210.8540.785-0.922

圖4 血清miR-21在復(fù)發(fā)患者血清中的表達量

ControlNSCLCNSCLC(Recrudesce)miR-21(2-ΔΔCt)1.81±1.755.03±3.8727.28±16.36

3 討論

miR21由單個基因編碼，其位于17p23.2的脆弱位點FRA17B上，并與編碼跨膜蛋白49的基因(TMEM49，也稱為VMP1)重疊[5]。miR21在肺癌，乳腺癌，膠質(zhì)母細胞瘤，胃癌，胰腺癌，胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，肝癌，膽管癌，結(jié)腸癌和前列腺癌中過表達[6-8]。miR21通過調(diào)節(jié)靶基因參與腫瘤細胞侵襲，血管浸潤和轉(zhuǎn)移等[9,10]。此外，miR21在結(jié)直腸癌患者中的高表達與臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，乳腺癌和肝轉(zhuǎn)移階段伴隨著miR21表達水平的增加[11]。一些研究也證實miR-21與化療耐藥相關(guān)，抑制膽管癌細胞中miR-21的表達可以增加細胞對吉西他濱的敏感性，高miR-21表達與基于5-FU的化療反應(yīng)差， 預(yù)后不良有關(guān)[4,12]。

因此，我們通過檢測非小細胞肺癌患者行新輔助化療前血清中miR-21的表達量，分析循環(huán)miR-21含量與NSCLC新輔助化療預(yù)后的關(guān)系。首先，通過對比85例NSCLC患者和30例正常對照組血清中miR-21含量，證實NSCLC患者血清中miR-21的相對表達量為12.54±14.54顯著高于其在正常對照組血清中的相對表達量1.81±1.75。另外，miR-21對診斷NSCLC的ROC的AUC為0.854(0.785-0.922)，最佳截取值為5.766，此時血清miR-21診斷NSCLC的敏感度為60.0%，特異度100.0%。這些結(jié)果說明miR-21可作為NSCLC的診斷標志物。進一步，我們將1年內(nèi)復(fù)發(fā)患者、未復(fù)發(fā)患者和正常對照組血清miR-21含量進行了比較，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)NSCLC患者血清中miR-21的相對表達量為27.28±16.36顯著高于未復(fù)發(fā)NSCLC組和正常對照組血清中的miR-21相對表達量5.03±3.87和1.81±1.75。這一結(jié)果說明循環(huán)miR-21含量越高患者預(yù)后越差。

綜上所述，循環(huán)miR-21可作為NSCLC的診斷標志物，GP方案對于循環(huán)miR-21含量較低的NSCLC患者具有較高的應(yīng)用價值。