貴州省食品檢驗檢測所(550004)高源 田莉 季偉 肖丹
貴州醫(yī)科大學(550025)劉尚瑩
食品防腐劑能抑制食品中微生物的繁殖,防止腐敗變質(zhì),延長保存期[1]。在食品加工過程中,人們采用了許多不同的手段來殺死或者抑制微生物,添加防腐劑是其中最方便而有效的一種方法,因而被廣泛使用于食品加工行業(yè)中[2]。然而許多商家和企業(yè)為了減小成本和謀取利益,出現(xiàn)了防腐劑的超標使用、違規(guī)使用、使用劣質(zhì)防腐劑、不在食品標簽中標注添加了防腐劑、超范圍使用防腐劑等幾種情況[3]?;瘜W合成防腐劑使用不當會有一定的副效應, 長期過量攝入會對身體健康造成危害[4]。主要表現(xiàn)在:影響人體新陳代謝平衡;對神經(jīng)系統(tǒng)的損害(如老年癡呆癥、帕金森綜合征及周圍神經(jīng)炎等疾病);影響胎兒生長發(fā)育;引起疊加中毒現(xiàn)象,可能構(gòu)成致癌危險等。因此,檢測人員做好相關(guān)質(zhì)量檢查工作是關(guān)鍵點??蒲袡z驗部門應深入研究,找出快速簡便、靈敏經(jīng)濟的檢測方法和適用儀器。實施檢測措施,完善檢測隊伍,加強對防腐劑含量的快速檢測,從而及時發(fā)現(xiàn)并處理相關(guān)違法情況。
1.1 主要儀器 eppendorf Centrifuge 5810R高速冷凍離心機;隔膜真空泵;戴安UltiMate3000高效液相色譜儀,Chromeleon色譜工作站; Thermo AcclaimTM色譜柱(C18,250×4.6㎜,5μm,柱號為006644);梅特勒分析天平;超聲水浴鍋;明澈D24UA純水超純水一體機。
1.2 標準品及試劑 標準品:純度為99.5%苯甲酸標準品(Dr.Ehrenstorfer GmbH);純度為99.0%山梨酸標準品(Dr.Ehrenstorfer GmbH)。試劑:乙酸銨(優(yōu)級純),成都艾科試劑;甲醇(色譜純),默克公司;乙酸鋅(優(yōu)級純);超純水;0.45μm微孔濾膜;亞鐵氰化鉀(優(yōu)級純);液相進樣小瓶。樣品:貴州省食品藥品檢驗所監(jiān)督抽查的辣椒醬樣品。模擬陽性樣品(在辣椒醬樣品中加入食品級的苯甲酸和山梨酸,均勻制樣,測定其含量)。
2.1 色譜條件 色譜柱:Thermo AcclaimTM色譜柱(C18 ,250×4.6㎜,5μm);流速:1mL/min;色譜柱溫:35℃;檢測波長:230nm;流動相:甲醇(0.02mol/L),乙酸銨(2:98);進樣量:10μL。見附圖1、2。
2.2 樣品前處理方法 隨機均勻取5.00g模擬樣品,精密稱定,共有六份,分置50mL離心管中,加入30mL超純水,充分搖勻后,再加入1mL亞鐵氰化鉀溶液,1mL乙酸鋅溶液,混勻,在離心管中定容至50mL刻度線,超聲處理15min后,以5000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min。取上清液用0.45微孔濾膜過濾,注入液相進樣小瓶,作為待測供試品溶液。
2.3 樣品測定 分別準確吸取山梨酸和苯甲酸標準和待測樣品溶液10μL注入液相色譜儀,記錄色譜峰面積/峰高,根據(jù)峰面積/峰高-山梨酸濃度曲線和峰面積/峰高-苯甲酸濃度曲線求得樣品中山梨酸和苯甲酸含量。
2.4 標準溶液的制備及線性范圍的測定 標準品儲備液的制備:精密稱取苯甲酸標準品0.01148g置于100mL容量瓶中,用甲醇超聲溶解后定容至刻度。精密稱取山梨酸標準品0.01216g于100mL容量瓶中,用甲醇超聲溶解后定容至刻度?;旌蠈φ掌啡芤褐苽洌喝∩嚼嫠針藴势穬湟?mL于100mL容量瓶中,取苯甲酸標準品儲備液10mL于100mL容量瓶中,均用水定容至刻度。所得山梨酸濃度為12.09μg/mL;苯甲酸濃度為10.54μg/mL。
分別吸取上述混合標準品溶液1、2、5、10、15、20mL置于50mL容量瓶中,定容至刻度。進樣量為10μL,分別進樣測定,記錄保留時間及峰面積,以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,得其回歸方程。
在4.57~182.8μg/mL范圍內(nèi)苯甲酸質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好,回歸方程為y=0.4007x-0.001,r=1。在2.14~85.76μg/mL范圍內(nèi)山梨酸質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好,回歸方程為y=0.6996x-0.0064,r=1。
2.5 精密度和重復性考察 取混合對照品溶液連續(xù)進樣6次,進樣量為10ul,可得出精密度苯甲酸峰面積相對標準偏差RSD是0.099%,山梨酸峰面積相對標準偏差RSD是0.13%。平行處理6次樣品,進樣量為10uL,在優(yōu)化色譜條件測得樣品重復性為,苯甲酸含量相對標準偏差RSD是0.69%,山梨酸含量相對標準偏差RSD是2.4%。說明其精密度,重復性良好。
2.6 加標回收率的考察 混合標準品溶液制備:精密稱取苯甲酸標準品0.01176g于50mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度。精密稱取山梨酸標準品0.01067g于50mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度。分別精密量取20mL苯甲酸標準儲備液、10mL山梨酸標準儲備液于200mL容量瓶中,稀釋至刻度,其濃度分別為23.40μg/mL、10.56μg/mL。
附圖1 苯甲酸、山梨酸標準品色譜圖
附圖2 苯甲酸、山梨酸樣品色譜圖
供試樣溶液制備:稱取上述模擬陽性樣品5.00g,共6份,精密稱定,分別置于50mL離心管中。其中1、2管精密加入混合標準溶液5mL,3、4管精密加入混合標準溶液15mL,5、6管精密加入混合標準溶液25mL,按2.2所述方法制備樣品溶液,精密吸取10μL,注入液相色譜儀測定。記錄峰面積值,計算苯甲酸,山梨酸回收率。其計算公式為:
回收率平均值苯甲酸為98.11%,RSD為1.5%,山梨酸為96.91%,RSD為1.6%。
2.7 實際檢出限的測定 苯甲酸實際檢出限的確定:吸取濃度為5.2525μg/mL苯甲酸標準品溶液0.4mL,置于裝有5.0g樣品的50mL容量瓶中,依照2.2所述方法進行樣品處理。精密吸取10μL注入液相色譜中,記錄苯甲酸峰高,與噪音相比,滿足3倍信噪比的要求,可得到苯甲酸的實際檢出限為0.4mg/Kg。
山梨酸實際檢出限的確定:吸取濃度為5.0705μg/mL山梨酸標準品溶液0.3mL,置于裝有5.0g樣品的50mL容量瓶中,依照2.2所述方法進行樣品處理。精密吸取10μL注入液相色譜中,記錄山梨酸峰高,與噪音相比,滿足3倍信噪比的要求,可得到山梨酸的實際檢出限為0.3mg/Kg。