北京市藥品認(rèn)證管理中心（100053）張聯(lián)

高效液相色譜法是20世紀(jì)60年代初期在經(jīng)典柱色譜基礎(chǔ)上，借鑒氣相色譜發(fā)展的經(jīng)驗創(chuàng)立的分離分析技術(shù)[1]，可實現(xiàn)對絕大多數(shù)有機化合物的分離分析?；驹硎窃诟邏毫ο?，利用不同組分在固定相和流動相之間相互作用力的差別，當(dāng)兩相做相對移動時，各溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行多次平衡，使各溶質(zhì)相互分離。高效液相色譜法在藥品生產(chǎn)和質(zhì)量控制中應(yīng)用廣泛，涉及藥品鑒別、雜質(zhì)控制、含量測定等諸多方面，已成為藥品檢驗的主流分析方法。

任何檢驗檢測的目的都是為了獲得穩(wěn)定、可靠、準(zhǔn)確和一致性的數(shù)據(jù)，但影響高效液相色譜法檢驗結(jié)果的因素很多，只有規(guī)范使用高效液相色譜法，保證檢驗方法適合于被檢樣品，同時確保檢驗人員有能力規(guī)范操作檢驗方法，才能取得可靠的數(shù)據(jù)。本文將以高效液相色譜法為中心，結(jié)合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）》、《中華人民共和國藥典》（2015年版）（以下簡稱《中國藥典》）以及相關(guān)技術(shù)性文件的原則要求，從質(zhì)量體系、檢驗方法驗證以及檢驗操作等方面進(jìn)行詳述，以促進(jìn)藥品生產(chǎn)企業(yè)規(guī)范化應(yīng)用高效液相色譜法，保障藥品質(zhì)量。

1 制藥質(zhì)量體系應(yīng)涵蓋藥品檢驗過程

藥品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立藥品質(zhì)量管理體系，該體系應(yīng)當(dāng)涵蓋影響藥品質(zhì)量的所有因素，包括確保藥品質(zhì)量符合預(yù)定用途的有組織、有計劃的全部活動[2]，當(dāng)然包括產(chǎn)品檢驗使用的高效液相色譜法。只有產(chǎn)品檢驗方法與企業(yè)質(zhì)量體系有機融合并規(guī)范使用才能保證檢驗結(jié)果符合數(shù)據(jù)可靠性的要求。為了實現(xiàn)藥品質(zhì)量，企業(yè)應(yīng)配備充足的檢驗人員，人員應(yīng)經(jīng)過培訓(xùn)、考核和評估，合格后方可上崗；企業(yè)高效液相色譜儀操作室的環(huán)境應(yīng)符合《液相色譜儀檢定規(guī)程》（JJG705-2014）要求；企業(yè)應(yīng)對儀器與試劑供應(yīng)商進(jìn)行評估分級，建立合格物料供應(yīng)商清單并保證物料具有可追溯的適當(dāng)質(zhì)量；儀器應(yīng)經(jīng)過確認(rèn)、定期檢定并保證儀器在生命周期中保持其驗證狀態(tài)。質(zhì)量體系的正常運行需要企業(yè)定期開展審核評估，對審核發(fā)現(xiàn)的缺陷采取糾正和預(yù)防措施，每年對檢驗結(jié)果的趨勢進(jìn)行分析，保證檢驗結(jié)果的穩(wěn)定性。

2 高效液相色譜儀的基本要求

2.1 高效液相色譜儀管理 企業(yè)應(yīng)根據(jù)在產(chǎn)產(chǎn)品檢驗需要配置適宜的高效液相色譜儀，包括自動進(jìn)樣器、高壓泵、柱溫箱、檢測器、計算機（含適當(dāng)?shù)牟僮飨到y(tǒng)）和工作站軟件等。文件應(yīng)明確儀器硬件變更、保養(yǎng)、維修后放行使用或停止使用的要求。新購或已安裝儀器關(guān)鍵硬件升級后均應(yīng)進(jìn)行安裝確認(rèn)、運行確認(rèn)和性能確認(rèn)等工作，確認(rèn)完成后應(yīng)進(jìn)行檢定，后續(xù)也應(yīng)滿足檢定周期要求。高效液相色譜儀應(yīng)有明確標(biāo)識，應(yīng)由授權(quán)人員操作儀器，使用時按照檢定規(guī)程要求進(jìn)行使用中檢查，并應(yīng)對儀器進(jìn)行定期清潔保養(yǎng)，儀器的使用日志應(yīng)記錄使用前檢查情況、使用情況和日常檢查項目。

2.2 高效液相色譜儀相關(guān)軟件的管理

2.2.1 企業(yè)應(yīng)對計算機操作系統(tǒng)的系統(tǒng)時間進(jìn)行控制，不能隨意更改。工作站軟件的用戶應(yīng)實名登錄使用，禁止不同人員使用同一賬號或同一人員使用不同用戶名登錄。用戶管理中應(yīng)對密碼長度、密碼更新周期、允許密碼輸入次數(shù)進(jìn)行規(guī)定以防止非法登錄。企業(yè)應(yīng)對使用者的權(quán)限進(jìn)行分組，根據(jù)軟件使用者的不同需求對軟件操作權(quán)限進(jìn)行分配。工作站軟件中崗位人員的權(quán)限分組應(yīng)與企業(yè)文件規(guī)定、檢驗原始記錄一致。高效液相色譜儀工作站軟件配置方式目前常用的有三類：單機版，數(shù)據(jù)以文件形式儲存在計算機中；DB版，為數(shù)據(jù)庫形式，可控儀器數(shù)量1～4臺，數(shù)據(jù)存放在計算機中，一般采用雙硬盤備份；網(wǎng)絡(luò)版，配備服務(wù)器，是DB版的擴展版本，理論上數(shù)據(jù)存儲無限制，可控儀器數(shù)量無限制，數(shù)據(jù)存儲在專用服務(wù)器中，安全性最好。企業(yè)可根據(jù)被檢樣品的需要配置相應(yīng)儀器，并應(yīng)在使用前完成計算機化系統(tǒng)驗證。

2.2.2 工作站軟件審計追蹤功能 高效液相色譜儀的工作站軟件應(yīng)開啟審計追蹤功能，記錄系統(tǒng)配置參數(shù)、儀器參數(shù)和數(shù)據(jù)分析參數(shù)的變更，實現(xiàn)數(shù)據(jù)審計追蹤功能，保證數(shù)據(jù)的可靠性。企業(yè)應(yīng)定期審核用戶權(quán)限變更和數(shù)據(jù)審計追蹤系統(tǒng)，重點關(guān)注是否存在刪除、修改色譜圖和數(shù)據(jù)等不規(guī)范行為，包括改變色譜圖的峰面積和試驗的時間，從多做的數(shù)據(jù)中挑選符合主觀需求的數(shù)據(jù)，一圖多用，以及刪除、覆蓋或重命名色譜圖數(shù)據(jù)。

2.2.3 數(shù)據(jù)備份與還原測試 工作站軟件中的數(shù)據(jù)應(yīng)定期備份，目前分為手動備份和自動備份，手動備份相當(dāng)于文件存檔，在工作站軟件日志瀏覽器中可以查看；自動備份，按儀器說明書執(zhí)行，可以采用定期定時的異地或A樓B樓備份，企業(yè)也可采用第三方軟件進(jìn)行雙機熱備。企業(yè)在進(jìn)行備份的同時應(yīng)進(jìn)行文件的還原測試，證明數(shù)據(jù)可恢復(fù)。

2.3 色譜柱的管理 色譜柱目前普遍使用商品化色譜柱，企業(yè)在采購檢驗標(biāo)準(zhǔn)中推薦的色譜柱時，應(yīng)對色譜柱進(jìn)行規(guī)范管理，包括色譜柱的采購、編號、首次使用柱效的測定、日常維護以及色譜柱的更換條件等，同時應(yīng)根據(jù)供應(yīng)商說明書的要求進(jìn)行儲存。色譜柱使用前應(yīng)關(guān)注色譜柱的儲存液與待分析樣品的流動相之間是否互溶。檢驗時色譜柱溫度會影響分離效果，檢驗標(biāo)準(zhǔn)中未指明色譜柱溫度時系指室溫。如檢驗方法耐用性驗證時發(fā)現(xiàn)室溫變化對色譜柱分離效果影響較大，則應(yīng)在檢驗標(biāo)準(zhǔn)中明確給出柱溫規(guī)定。

附表 推薦的定量分析進(jìn)樣測定序列

3 檢驗方法的管理

3.1 檢驗標(biāo)準(zhǔn)的確認(rèn) 目前我國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)包括《中國藥典》、部/局頒標(biāo)準(zhǔn)和進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)稱為法定標(biāo)準(zhǔn)。通常藥品生產(chǎn)企業(yè)采用的檢驗標(biāo)準(zhǔn)均為藥品注冊批件中的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。一般而言，國家藥品標(biāo)準(zhǔn)是對藥品的最基本質(zhì)量要求，對于藥品生產(chǎn)企業(yè)來說，其出廠內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)通常高于國家法定標(biāo)準(zhǔn)。所以企業(yè)應(yīng)按照《中國藥典》的指導(dǎo)原則，以法定標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，結(jié)合企業(yè)產(chǎn)品的特點確認(rèn)具體檢驗項目及限度要求。

3.2 檢驗方法驗證 任何檢驗檢測均需要通過確認(rèn)或驗證的方式來證明該檢驗方法的正確性。當(dāng)企業(yè)采用新建立的檢驗方法、檢驗方法需要修改變更或采用《中國藥典》及其他法定標(biāo)準(zhǔn)未收載的檢驗方法時，應(yīng)當(dāng)對檢驗方法進(jìn)行驗證[2]。但檢驗方法的驗證結(jié)論不是持久永恒的，企業(yè)應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)或檢驗的變更進(jìn)行再驗證，并通過對變更的風(fēng)險評估確定驗證的廣度和深度。

3.2.1 檢驗方法驗證方式 企業(yè)必須與法定標(biāo)準(zhǔn)收載的方法進(jìn)行比較，并證明它等同于或優(yōu)于法定方法且必須進(jìn)行驗證。通過實驗證明用于檢驗的分析程序適合于預(yù)期用途。檢驗方法驗證應(yīng)作為驗證主文件的一部分，建立目的明確的驗證方案，驗證內(nèi)容應(yīng)包括《藥品質(zhì)量分析方法驗證指導(dǎo)原則》[3]中規(guī)定的項目，驗證方案或報告中應(yīng)記錄每一參數(shù)的接受標(biāo)準(zhǔn)和驗證結(jié)果，最后驗證報告結(jié)論應(yīng)經(jīng)正式批準(zhǔn)。對不需要進(jìn)行驗證的檢驗方法，企業(yè)應(yīng)當(dāng)對檢驗方法進(jìn)行確認(rèn)，以確保檢驗數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠。

3.2.2 檢驗方法轉(zhuǎn)移 當(dāng)檢驗方法不是由企業(yè)實驗室自行建立，而是委托其他實驗室完成時，兩個實驗室之間應(yīng)當(dāng)完成方法的轉(zhuǎn)移，以證明企業(yè)實驗室具有實施新方法的能力。在檢驗方法轉(zhuǎn)移中，方法通常要在不同實驗室，不同人員，不同儀器條件下使用，此時應(yīng)依據(jù)實驗室和方法的特點選擇適宜的檢驗參數(shù)，進(jìn)行再驗證或只對某些檢驗參數(shù)進(jìn)行驗證(部分驗證)。轉(zhuǎn)移和接收實驗室應(yīng)該在轉(zhuǎn)移驗證開始前就驗證參數(shù)和可接受標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成一致，轉(zhuǎn)移實驗室應(yīng)該為接收實驗室提供適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)。

4 檢驗操作流程

4.1 檢驗操作準(zhǔn)備

4.1.1 溶液配制 在檢驗操作中，為減少溶劑峰與色譜峰的畸變，應(yīng)盡可能使用流動相按照檢驗標(biāo)準(zhǔn)的要求配制供試品溶液與對照品溶液，正確標(biāo)識并按要求儲存。企業(yè)可根據(jù)檢驗需要考察配制的供試品溶液與對照品溶液的穩(wěn)定性，同時個別產(chǎn)品須控制溶液配制后至進(jìn)樣檢驗的時間間隔。4.1.2被檢樣品進(jìn)樣測定序列 在執(zhí)行檢驗方法過程中所有的步驟都要驗證，包括進(jìn)樣的順序，推薦的定量分析進(jìn)樣測定序列見附表，企業(yè)可根據(jù)被檢樣品酌情調(diào)整。驗證后的分析程序就是檢驗樣品的準(zhǔn)則，只在驗證范圍之內(nèi)變動是允許的，否則必須重新進(jìn)行局部性的驗證。系統(tǒng)適用性試驗的對照品重復(fù)進(jìn)樣應(yīng)在被檢樣品檢驗前進(jìn)行或在被檢樣品進(jìn)樣時間隔進(jìn)樣，并應(yīng)貫穿檢驗始終包括檢驗結(jié)束時。系統(tǒng)適用性試驗如果不符合規(guī)定，必須立即停止儀器運作，進(jìn)行OOS調(diào)查，修正后再重新開始。除了系統(tǒng)適用性試驗的五針之外，在隨后的對照品溶液進(jìn)樣，要把對照品1的試驗結(jié)果加入，然后再計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，任何時間，如果偏差過大必須停止運行。在檢驗的進(jìn)樣測定序列完成后，從開始至結(jié)束所有的對照品1的數(shù)據(jù)，必須拿來計算該進(jìn)樣序列的系統(tǒng)精密度。如果超標(biāo)，那么整個數(shù)據(jù)不能使用。若有趨勢逐漸超標(biāo)，應(yīng)調(diào)查原因，并重新進(jìn)樣，之前的數(shù)據(jù)不可使用但應(yīng)記錄該過程。在檢驗進(jìn)行過程中，如果發(fā)現(xiàn)有任何偏差，必須立即停止檢驗操作并開展偏差調(diào)查，只有對偏差調(diào)查結(jié)果采取適當(dāng)?shù)募m正預(yù)防措施后才可繼續(xù)進(jìn)行檢驗操作。

4.2 被檢樣品檢驗

4.2.1 色譜系統(tǒng)的平衡 為了得到理想的檢驗結(jié)果，不僅需要有好的實驗方法，還需要有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牟僮鬟^程。企業(yè)應(yīng)按照驗證的方法和進(jìn)樣測定序列開展檢驗工作。色譜系統(tǒng)的平衡工作包括：泵沖洗；進(jìn)樣器沖洗；使用流動相沖洗管路；預(yù)熱，流動相在低流速下工作直到柱溫達(dá)到室溫或各論規(guī)定的溫度；色譜柱柱平衡，使用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的已脫氣流動相在規(guī)定的流速下平衡色譜柱；應(yīng)檢查基線噪聲和基線漂移是否在設(shè)定值范圍內(nèi)，可使用軟件的相應(yīng)功能鍵進(jìn)行基線檢查；基線斜率的計算結(jié)果應(yīng)符合要求。

4.2.2 系統(tǒng)適用性試驗 檢驗之前進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗是檢驗方法的組成部分，用于證明儀器、電子設(shè)備、分析操作適合被檢樣品，參數(shù)的選擇與檢驗方法的目的和性質(zhì)有關(guān)，色譜系統(tǒng)常用參數(shù)如理論塔板數(shù)、分離度、靈敏度、重復(fù)性或拖尾因子等。實驗室應(yīng)按驗證的方法對色譜系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗，即用規(guī)定的對照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗，以確保試驗系統(tǒng)的有效性。必要時可對色譜系統(tǒng)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整以符合要求，品種正文項下規(guī)定的條件除填充劑種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余參數(shù)可參考《中國藥典分析檢測技術(shù)指南》進(jìn)行調(diào)整，以達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗的要求。儀器或關(guān)鍵試劑變更應(yīng)再次進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗。不進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗或系統(tǒng)適用性試驗失敗，則被檢樣品的檢驗結(jié)果不可接受。當(dāng)對檢驗結(jié)果產(chǎn)生爭議時，仍以法定標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的色譜條件的檢驗結(jié)果為準(zhǔn)。

4.2.3 數(shù)據(jù)采集 高效液相色譜儀工作站軟件的數(shù)據(jù)采集一般分為單次運行和實時批處理。數(shù)據(jù)采集參數(shù)包括停止時間、流動相流速、柱溫箱溫度、檢測波長、梯度洗脫不同流動相的比例等，在進(jìn)樣時需輸入數(shù)據(jù)文件名稱、采樣瓶號和進(jìn)樣體積等信息。實時批處理時批檢驗表格應(yīng)符合企業(yè)驗證的進(jìn)樣測定序列。

4.3 數(shù)據(jù)分析 企業(yè)在對色譜圖進(jìn)行積分過程中的參數(shù)設(shè)定應(yīng)與驗證過程和文件要求一致，包括疊加峰處理，基線漂移，未分離峰的積分，峰面積的計算，舍棄不需要的小峰等。企業(yè)應(yīng)禁止隨意改變峰面積以使檢驗結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)要求的行為，包括通過調(diào)整積分參數(shù)的方式改變峰面積大??；通過設(shè)置最小積分面積或高度舍棄主觀不想要的色譜峰；鎖定積分時間程的形式變更總積分面積；違規(guī)處理拖尾峰。企業(yè)根據(jù)產(chǎn)品檢驗需要可設(shè)置手動積分權(quán)限，但應(yīng)對積分權(quán)限的使用進(jìn)行嚴(yán)格控制。

4.4 檢驗報告 企業(yè)應(yīng)制定檢驗報告的管理文件，規(guī)定色圖譜報告模板至少應(yīng)包括頁眉、信息欄、色譜圖、峰表、頁腳等信息。批準(zhǔn)的檢驗報告、工作站軟件中的報告模板應(yīng)與文件規(guī)定一致。

高效液相色譜法是藥品生產(chǎn)企業(yè)控制藥品質(zhì)量的關(guān)鍵技術(shù)，是保證藥品質(zhì)量的關(guān)鍵一環(huán)。企業(yè)應(yīng)以專業(yè)知識為基礎(chǔ)，按照藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范和數(shù)據(jù)可靠性的要求，建立科學(xué)的制藥質(zhì)量體系。通過體系文件、必要的驗證、嚴(yán)格的操作、同步記錄等規(guī)范化的使用，保證取得的檢驗數(shù)據(jù)真實可靠，有效保障藥品質(zhì)量。