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        固相萃取LC-MS/MS法測定疏血通注射液中次黃嘌呤濃度*

        2019-10-24 06:29:58王獻(xiàn)瑞趙西子王曉明郭亞卿潘桂湘黃宇虹
        關(guān)鍵詞:峰形次黃嘌呤甲酸

        王獻(xiàn)瑞 ,趙西子 ,王曉明 ,郭亞卿 ,潘桂湘 ,黃宇虹

        (1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育),天津 301617;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,天津 300250)

        疏血通注射液是由水蛭[1-2]、地龍[3-4]兩味動物類中藥經(jīng)低溫提取和膜分離等工藝制成的中藥復(fù)方制劑[5],具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)的功效,臨床常用于瘀血阻絡(luò)所致的缺血性中風(fēng)病中經(jīng)絡(luò)急性期,癥見半身不遂、口舌歪斜、語言謇澀[6-7]。疏血通注射液化學(xué)成分復(fù)雜,含有多肽、多糖、氨基酸、次黃嘌呤等物質(zhì)[8-10],目前其真正發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11-12],次黃嘌呤具有明確的生物活性,能透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),提高多種酶的活性,參與機(jī)體一些重要生理機(jī)能的調(diào)節(jié)。因此,本文以次黃嘌呤為指標(biāo)成分,建立液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法對其進(jìn)行定量分析,以期為疏血通注射液質(zhì)量分析、評價以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考和依據(jù)。

        目前,疏血通注射液中次黃嘌呤的測定,采用的大多是高效液相色譜-紫外法(HPLC-UV)[13-14],檢測波長為254 nm。由于疏血通注射液中眾多成分在254 nm處具有紫外吸收,需進(jìn)行長達(dá)50 min的梯度洗脫,使次黃嘌呤與注射液中的其他干擾物質(zhì)實(shí)現(xiàn)完全的色譜分離,次黃嘌呤出峰時間為13min,整個分析周期相對較長[15]。LC-MS/MS具有高選擇性、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)[21],尤其是具有獨(dú)特的質(zhì)量分辨能力,能在復(fù)雜基質(zhì)中專屬、靈敏、準(zhǔn)確地檢測某個或某幾個成分。本研究采用固相萃取LC-MS/MS法測定疏血通注射液中次黃嘌呤濃度,分析時間縮短至3.50 min,次黃嘌呤出峰時間為1.02 min,可較大程度提高分析的效率。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀(美國waters公司),Waters Xevo TQ-S三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國waters公司);MiniSpin Plus高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司),AX205十萬分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo公司),Synergy UV超純水機(jī)(美國Millipore公司)。

        1.2 試劑和藥品 疏血通注射液(牡丹江友博藥業(yè)股份有限公司)。次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品(德國Sigma公司,純度99%以上),6-巰基嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品(德國Aldrich公司,純度98%以上)。甲醇(色譜純,德國Sigma公司),甲酸(色譜純,ROE公司),超純水為Millipore超純水系統(tǒng)制得。Sep-pak C18固相小柱(500 mg,waters公司)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀系統(tǒng):二元泵系統(tǒng)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱,Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)分析柱,BEH C18(5 mm×2.1 mm,1.7 μm)保護(hù)柱;流動相為甲醇(A),0.1%甲酸水(B),流速:0.3 mL/min;柱溫40℃,進(jìn)樣量2 μL,分析時間為3.50 min。梯度洗脫程序見表1。

        表1 色譜條件梯度洗脫程序表

        2.2 質(zhì)譜條件 Waters Xevo TQ-S三重四極桿質(zhì)譜,ESI負(fù)離子模式,MRM掃描方式。參數(shù)設(shè)置:毛細(xì)管電壓3.0 kV,錐孔電壓30 V,氮?dú)鈮毫? psi,脫溶劑氣溫度400℃,脫溶劑氣流速800 L/h,錐孔氣流速150 L/h,碰撞氣流速0.15 mL/min。化合物MRM方法參數(shù)見表2。

        表2 次黃嘌呤與內(nèi)標(biāo)的MRM方法參數(shù)

        2.3 溶液的制備

        2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取次黃嘌呤適量,加甲醇制成100 μg/mL的次黃嘌呤儲備液;另稱取內(nèi)標(biāo)6-巰基嘌呤適量,少量甲醇溶解后用甲醇-水(含0.2%甲酸)(2∶8) 配制成 125 μg/mL 的 6-巰基嘌呤儲備液。用甲醇-水(2∶8,含0.2%甲酸)稀釋上述儲備液,制得含次黃嘌呤系列濃度 500、400、300、200、100 ng/mL的混合對照品溶液(含內(nèi)標(biāo)250 ng/mL)。2.3.2 供試品溶液制備 精密移取100 μL疏血通注射液和100 μL濃度為125 μg/mL的6-巰基嘌呤溶液,加于已活化的C18固相萃取小柱上,用300 μL水洗除雜,再用 1.00 mL 甲醇-水(2∶8,含 0.2%甲酸)洗脫,取洗脫液 100 μL 用甲醇-水(2∶8,含 0.2%甲酸)稀釋 10倍,搖勻,再取 200 μL用甲醇-水(2∶8,含0.2%甲酸)稀釋5倍,混勻,即得。

        2.3.3 陰性對照液制備 取1 mL疏血通注射液,加黃嘌呤氧化酶37℃水浴溫孵2h,精密移取100μL經(jīng)酶促反應(yīng)后的疏血通注射液,加于C18固相萃取小柱上,其余按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作,制成不含次黃嘌呤的陰性對照液。

        2.4 專屬性試驗(yàn) 取陰性對照液、對照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣測定,次黃嘌呤、6-巰基嘌呤色譜峰形良好,測定無干擾,次黃嘌呤保留時間為1.02 min,6-巰基嘌呤保留時間為1.22 min,結(jié)果見圖1。

        圖1 疏血通注射液中次黃嘌呤及內(nèi)標(biāo)的MRM色譜圖

        2.5 線性關(guān)系考察 吸取“2.3.1”項(xiàng)下系列濃度混合對照品溶液,進(jìn)樣2 μL測定,以次黃嘌呤質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸,得回歸方程Y=4.299×10-3X+9.246×10-3,r=0.999,表明次黃嘌呤在0.1~0.5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

        2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對照品混合溶液2 μL,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次,測得次黃嘌呤與內(nèi)標(biāo)峰面積比值,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.54%,表明儀器精密度良好。

        2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密移取同一批號的疏血通注射液 100 μL,按“2.3.2”項(xiàng)制備供試品溶液,平行6份,進(jìn)樣測定,RSD為0.86%,表明樣品重現(xiàn)性良好。

        2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 室溫下,精密吸取同一供試品溶液 2 μL,分別在 0、2、4、6、8、12、24、48 h 進(jìn)樣,測次黃嘌呤與內(nèi)標(biāo)峰面積比值,RSD為0.84%。結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密移取同一批號已知含量的疏血通注射液6份,每份50 μL,精密加入濃度為 200 ng/mL 的對照品溶液 28 μL,按“2.3.2”項(xiàng)下處理與測定,計(jì)算回收率,結(jié)果見表3。

        表3 次黃嘌呤加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

        2.10 樣品濃度測定 分別精密移取各批號疏血通注射液 100 μL,按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,內(nèi)標(biāo)法計(jì)算次黃嘌呤濃度,結(jié)果見表4。

        3 討論

        3.1 流動相的選擇 實(shí)驗(yàn)分別考察了乙腈-水和甲醇-水等流動相系統(tǒng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用乙腈-水或乙腈-水(含0.1%甲酸)為流動相時,次黃嘌呤峰形尖而細(xì),但主峰后出現(xiàn)一個小的裂分峰;當(dāng)使用甲醇-水為流動相時,次黃嘌呤峰形較寬,且裂分為兩個大小相當(dāng)?shù)碾p峰,但若將水相改為0.1%甲酸水時,即以甲醇-水(含0.1%甲酸)為流動相,峰形對稱尖銳且未出現(xiàn)裂分,響應(yīng)較高。當(dāng)以甲醇-水(含0.2%甲酸)為流動相時,其峰形和響應(yīng)與甲醇-水(含0.1%甲酸)相當(dāng),考慮到色譜柱對酸的耐受程度,實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇-水(含0.1%甲酸)作為流動相。

        表4 疏血通注射液中次黃嘌呤濃度測定結(jié)果

        3.2 稀釋溶劑的選擇 在供試品和對照品溶液制備過程中,發(fā)現(xiàn)終溶液如果所含甲醇比例較高,會因與流動相不匹配而產(chǎn)生強(qiáng)溶劑效應(yīng),導(dǎo)致色譜峰形的畸變;反之,如果采用純水稀釋系列溶液,則會因?yàn)閮?nèi)標(biāo)在水中的溶解度低而析出形成渾濁液體。實(shí)驗(yàn)考察比較了甲醇-水系統(tǒng)(水相不含,或含有0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.3%甲酸) 不同比例 5∶5、4∶6、3∶7 和2∶8作為稀釋劑時,次黃嘌呤和內(nèi)標(biāo)6-巰基嘌呤的峰形和響應(yīng),結(jié)果表明當(dāng)以甲醇-水(2∶8,含0.2%甲酸)為稀釋劑時,二者的響應(yīng)最高且峰形良好。

        3.3 離子源的選擇 考察了待測物在ESI和APCI兩種電離方式下的響應(yīng),發(fā)現(xiàn)采用APCI電離源,次黃嘌呤和6-巰基嘌呤的響應(yīng)極其微弱,而采用ESI電離源二者的響應(yīng)提高了幾個數(shù)量級,這可能與次黃嘌呤和6-巰基嘌呤均為極性化合物有關(guān),更適合選用ESI電離源。

        3.4 電離方式的選擇 將次黃嘌呤和6-巰基嘌呤對照品溶液經(jīng)由蠕動泵連續(xù)進(jìn)樣,比較正、負(fù)電離方式下化合物的響應(yīng),發(fā)現(xiàn)次黃嘌呤和6-巰基嘌呤在負(fù)離子模式下,均可產(chǎn)生響應(yīng)較高且穩(wěn)定的[MH]-離子。因此選擇在負(fù)離子模式下采用MRM掃描方式檢測。

        3.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 本文建立的分析方法可方便、準(zhǔn)確測定疏血通注射液中次黃嘌呤濃度,為其提供技術(shù)支持,較常規(guī)UV檢測方法可大大縮短分析時間。國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的WS3-548(Z-084)-2005(Z)文件,要求疏血通注射液中含次黃嘌呤不得低于0.05 mg/mL,由表4可見,20個批次疏血通注射液中次黃嘌呤濃度穩(wěn)定集中在0.117~0.138 mg/mL,即(0.129±0.005)mg/mL(n=20),表明產(chǎn)品質(zhì)量合格、生產(chǎn)工藝穩(wěn)定,次黃嘌呤可作為疏血通注射液質(zhì)量分析、評價的指標(biāo)成分。

        4 結(jié)論

        本文所建立的固相萃取LC-MS/MS方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏,可用于疏血通注射液中次黃嘌呤濃度測定。

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