朱為梅，張靜思，楊紅玲，華鵬，徐麗芬

（1.云南省第三人民醫(yī)院，云南 昆明 650011；2.云南省老干部醫(yī)院，云南 昆明 650034）

當(dāng)前重金屬污染已經(jīng)成為影響人民群眾健康的一大病因[1-2]。2016年云南省第三人民醫(yī)院對(duì)云南省某重工業(yè)城市進(jìn)行了大范圍鉛中毒和非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)芈糟U中毒廣泛流行，同時(shí)鉛中毒NAFLD患者血清同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）相對(duì)無鉛中毒NAFLD患者明顯升高[3]。因此筆者推測(cè)在NAFLD發(fā)生和發(fā)展過程中，鉛可能會(huì)損傷Hcy代謝酶，最終造成血清Hcy升高。為此本研究從Hcy合成和分解途徑考查鉛中毒對(duì)NAFLD大鼠的影響，為今后鉛中毒和NAFLD的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)條件無特定病原體級(jí) SD 大鼠40只，體重160～180 g，雌雄各半，均購于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（動(dòng)物合格證號(hào)：2011-007），購買后飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)小動(dòng)物飼養(yǎng)房，飼養(yǎng)溫度控制在18～26℃，濕度控制在55%～65%，光照和黑暗條件下各12 h，實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過（審批號(hào) R-082018044）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料普通和高脂飼料、墊料（昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），Hcy檢測(cè)試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），醋酸鉛（武漢博士德生物公司），鉛測(cè)定試劑盒（北京匯智泰康生物技術(shù)有限公司），白細(xì)胞介素 -1α（Interleukin-1α,IL-1α）和白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β） 試 劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）和腫瘤壞死因子 -α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司），MTHFR、MTR、CBS和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（美國Santa公司），二抗（北京中山金橋公司），總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），引物（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器可見光分光光度計(jì)（722-S 型，上海光學(xué)儀器廠），電子分析天平（FA1004型，上海光學(xué)儀器一廠），自動(dòng)脫水機(jī)（ASP-300S型，德國Leica公司），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（5427R型，德國Eppendorf公司），手動(dòng)切片機(jī)（KM2245型，德國Leica公司），生物組織包埋機(jī)（BMJ-1型，上海珂淮儀器有限公司），生物攝影顯微鏡（Eclipse E200型，日本Nikon公司），全自動(dòng)生化分析儀（C8008型，美國雅培公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理所有大鼠在購買后給予適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，然后按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為普通飼料組、低鉛染毒普通飼料組（0.3 g/kg含醋酸鉛普通飼料）、高脂飼料組及低鉛染毒高脂飼料組（0.3 g/kg含醋酸鉛高脂飼料，劑量的確定根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]報(bào)道的最低劑量），每組10只[4]。標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)8周后處死所有大鼠。

1.2.2 標(biāo)本采集大鼠分批次隔夜禁食 12 h，于次日采用4%水合氯醛3 ml/（kg·d）麻醉處死，將其固定于解剖板，采用心臟取血法收集血液，取5 ml置于抗凝管中交由本院檢驗(yàn)科檢測(cè)，其余血液4 000 r/min離心10 min收集上清，備用于相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè)。收集血液后，取出肝臟，統(tǒng)一切取肝左葉置于4%甲醛溶液中用于病理學(xué)檢測(cè)，其余肝臟切成4小塊，其中1小塊置入凍存管中備用于RNA檢測(cè)，其余直接放入超低溫冰箱中用于Western blotting和肝鉛檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 血清指標(biāo)血清肝功能指標(biāo)谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase,AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、Hcy、葉酸及維生素 B12的測(cè)定采用全自動(dòng)生化分析儀，血鉛和肝鉛的測(cè)定儀器為分光光度計(jì)，IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α的檢測(cè)儀器為全自動(dòng)生化分析儀。血鉛、肝鉛、IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α的測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 肝臟組織病理學(xué)肝臟組織病理學(xué)檢查采用蘇木精 - 伊紅（hematoxylin-eosin staining,HE）染色，其步驟按照常規(guī)方法進(jìn)行：從中性甲醛溶液中取出肝臟組織，自來水過夜沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片[5]。

1.3.3 Westernblotting蛋白表達(dá)采用Western blotting檢測(cè)，從超低溫冰箱中取出肝臟組織，每組精確稱取100 mg，用組織裂解液裂解后離心并收集上清，BCA法檢測(cè)蛋白濃度并定量，每組各取50μg行SDS-PAGE，電泳完成后半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF，5%脫脂牛奶封閉2 h后洗滌3次，加入一抗[MTR（1 ∶ 2 000）、CBS（1 ∶ 3 000）、MTHFR（1 ∶ 3 000）和β-actin（1∶ 5 000）]， 搖床搖動(dòng)30 min后 置于4℃冰箱中過夜，次日取出后洗滌3次，加入二抗（l∶5 000）孵育1 h，洗滌3次，暗室曝光壓片。采用掃描儀收集圖像，Image J軟件計(jì)算并分析條帶灰度，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR）采用天根總RNA提取試劑盒提取總RNA，定量并調(diào)平，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 s，95℃變性 5 s，60℃退火 31 s，共40個(gè)循環(huán)。采用 2-ΔΔCt法測(cè)定并分析各組大鼠MTR、CBS和MTHFR mRNA相對(duì)表達(dá)量。見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝臟病理學(xué)

普通飼料組和低鉛染毒普通飼料組肝臟切片表面光滑，肝細(xì)胞排列緊密，而高脂飲食組和低鉛染毒高脂飼料組則出現(xiàn)明顯脂肪空泡，此外也有一定的炎癥因子浸潤，特別是低鉛染毒高脂飼料組，脂肪空泡更大且數(shù)量更多。見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理切片（×400）

2.2 各組大鼠血鉛和肝鉛比較

各組大鼠血鉛和肝鉛含量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。低鉛染毒普通飼料組和低鉛染毒高脂飼料組均高于普通飼料組（P＜0.05），低鉛染毒高脂飼料組高于低鉛染毒普通飼料組和高脂飼料組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血鉛和肝鉛比較（n =10，μg/ml，±s）

表2 各組大鼠血鉛和肝鉛比較（n =10，μg/ml，±s）

注：①與普通飼料組比較，P ＜0.05；②與低鉛染毒普通飼料組，P ＜0.05；③與高脂飼料組比較，P ＜0.05。

組別 血鉛 肝鉛普通飼料組0.11±0.04 0.88±0.37低鉛染毒普通飼料組0.25±0.09① 2.42±0.87①高脂飼料組0.13±0.10 0.95±0.43低鉛染毒高脂飼料組0.32±0.12①②③ 3.22±1.19①②③F值 37.792 21.458 P值 0.000 0.000

2.3 各組大鼠 AST、ALT 比較

各組大鼠AST、ALT比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。低鉛染毒普通飼料組、高脂飼料組和低鉛染毒高脂飼料組均高于普通飼料組（P＜0.05），高脂飼料組和低鉛染毒高脂飼料組高于低鉛染毒普通飼料組（P＜0.05），低鉛染毒高脂飼料組高于高脂飼料組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠 AST、ALT 比較（n =10，u/L，±s）

表3 各組大鼠 AST、ALT 比較（n =10，u/L，±s）

注：①與普通飼料組比較，P ＜0.05；②與低鉛染毒普通飼料組，P ＜0.05；③與高脂飼料組比較，P ＜0.05。

組別 ALT AST普通飼料組72.85±4.35 153.14±9.40低鉛染毒普通飼料組81.17±8.33① 171.43±12.27①高脂飼料組97.24±9.98①② 195.15±17.82①②低鉛染毒高脂飼料組118.75±18.34①②③ 233.19±19.16①②③F值 35.791 24.422 P值 0.000 0.000

2.4 各組大鼠血清 Hcy、葉酸及維生素 B12 比較

各組大鼠Hcy、葉酸及維生素B12比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高脂飼料組和低鉛染毒高脂飼料組Hcy高于普通飼料組和低鉛染毒普通飼料組（P＜0.05），葉酸和維生素B12低于普通飼料組和低鉛染毒普通飼料組（P＜0.05）；低鉛染毒高脂飼料組Hcy高于高脂飼料組（P＜0.05），葉酸和維生素B12低于高脂飼料組（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠 Hcy、葉酸及維生素 B12 比較（n =10，±s）

表4 各組大鼠 Hcy、葉酸及維生素 B12 比較（n =10，±s）

注：①與普通飼料組比較，P ＜0.05；②與低鉛染毒普通飼料組，P ＜0.05；③與高脂飼料組比較，P ＜0.05。

維生素B12/（ng/ml）普通飼料組5.42±0.32 5.12±0.36 1.11±0.21低鉛染毒普通飼料組5.47±0.34 5.03±0.41 1.05±0.15高脂飼料組6.86±0.75①② 4.59±0.58①② 0.76±0.18①②低鉛染毒高脂飼料組8.74±1.09①②③ 4.37±0.82①②③ 0.65±0.12①②③F值 4.242 3.386 4.487 P值 0.002 0.005 0.001組別 Hcy/（μmol/L）葉酸/（ng/ml）

2.5 各組大鼠炎癥因子比較

各組大鼠IL-1α、IL-1β、IL-6及TNF-α比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高脂飼料組和低鉛染毒高脂飼料組均高于普通飼料組和低鉛染毒普通飼料組（P＜0.05），低鉛染毒高脂飼料組高于高脂飼料組（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠血清炎癥因子比較（n =10，ng/ml，±s）

表5 各組大鼠血清炎癥因子比較（n =10，ng/ml，±s）

注：①與普通飼料組比較，P ＜0.05；②與低鉛染毒普通飼料組，P ＜0.05；③與高脂飼料組比較，P ＜0.05。

組別 IL-1α IL-1β IL-6 TNF-α普通飼料組0.24±0.05 0.22±0.06 0.75±0.12 1.65±0.21低鉛染毒普通飼料組0.25±0.07 0.23±0.05 0.78±0.15 1.72±0.40高脂飼料組0.42±0.12①② 0.39±0.09①② 1.42±0.25①② 2.23±0.52①②低鉛染毒高脂飼料組0.57±0.12①②③ 0.45±0.06①②③ 1.98±0.43①②③ 2.98±0.74①②③F值 35.465 32.647 21.438 24.872 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.6 各組大鼠肝臟中MTHFR、MTR 及CBS蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

各組肝臟中MTR、CBS蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠肝臟中MTHFR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高脂飼料組和低鉛染毒高脂飼料組低于普通飼料組（P＜0.05），低鉛染毒高脂飼料組低于高脂飼料組（P＜0.05）；低鉛染毒普通飼料組與普通飼料組MTHFR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表6和圖2。

表6 各組大鼠肝臟中 MTHFR、MTR 及 CBS 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n =10，±s）

表6 各組大鼠肝臟中 MTHFR、MTR 及 CBS 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n =10，±s）

注：①與普通飼料組比較，P ＜0.05；②與低鉛染毒普通飼料組，P ＜0.05；③與高脂飼料組比較，P ＜0.05。

MTHFR MTR CBS普通飼料組0.52±0.08 0.63±0.06 0.55±0.04低鉛染毒普通飼料組0.57±0.06 0.65±0.04 0.56±0.05高脂飼料組0.36±0.07①② 0.61±0.07 0.58±0.07低鉛染毒高脂飼料組0.23±0.09①②③ 0.64±0.06 0.59±0.05 F值 22.385 1.476 1.886 P值 0.000 0.105 0.102組別

圖2 各組大鼠肝臟中 MTHFR、MTR 及 CBS 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n =10，±s）

2.7 各組大鼠肝臟中 MTHFR、MTR 及 CBS mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

各組肝臟中MTR、CBS mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠肝臟中MTHFR mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高脂飼料組和低鉛染毒高脂飼料組低于普通飼料組（P＜0.05），低鉛染毒高脂飼料組低于高脂飼料組（P＜0.05）；低鉛染毒普通飼料組和普通飼料組MTHFR mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表7和圖3。

表7 各組大鼠肝臟中 MTHFR、MTR 及 CBS mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（n =10，±s）

表7 各組大鼠肝臟中 MTHFR、MTR 及 CBS mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（n =10，±s）

注：①與普通飼料組比較，P ＜0.05；②與低鉛染毒普通飼料組，P ＜0.05；③與高脂飼料組比較，P ＜0.05。

MTHFR MTR CBS普通飼料組1.01±0.02 1.00±0.04 1.01±0.02低鉛染毒普通飼料組0.97±0.04 0.97±0.05 1.03±0.06高脂飼料組0.62±0.06①② 1.01±0.06 1.02±0.05低鉛染毒高脂飼料組0.38±0.07①②③ 1.03±0.04 0.99±0.05 F值 20.189 1.441 1.533 P值 0.000 0.106 0.104組別

圖3 各組大鼠肝臟中 MTHFR、MTR 及 CBS mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（n =10，±s）

3 討論

近年來國內(nèi)外對(duì)鉛中毒進(jìn)行了大量的流行病學(xué)研究[2]。以我國為例，2009年以來鉛中毒特別是慢性鉛中毒呈高發(fā)態(tài)勢(shì)[6-7]。急性鉛中毒患者主要集中于鉛礦工作人員，而普通人群中多數(shù)為慢性鉛中毒，且發(fā)病人數(shù)更多、更廣。慢性鉛中毒患者與正常人群在多種疾病的發(fā)生率上沒有明顯差異，但是對(duì)于有基礎(chǔ)疾病的慢性鉛中毒患者血清多項(xiàng)指標(biāo)則明顯高于正常人群，而Hcy則是一個(gè)差異指標(biāo)。鉛中毒的脂肪肝患者血清Hcy較無鉛中毒的脂肪肝患者明顯升高。而Hcy的升高與患者代謝密切相關(guān)。

Hcy在體內(nèi)的生成和分解主要通過MTHFR、MTR和CBS 3種酶來進(jìn)行，首先為轉(zhuǎn)硫基途徑，調(diào)節(jié)酶蛋白為CBS，CBS可催化Hcy和絲氨酸縮合生成胱硫醚，胱硫醚進(jìn)一步可生成谷胱甘肽以提高機(jī)體抗氧化能力[8-11]。另一條途徑為調(diào)節(jié)蛋白酶為MTR和MTHFR，在MTR的催化下Hcy和甲基四氫葉酸可生成蛋氨酸和四氫葉酸，蛋氨酸可直接被人體利用，而四氫葉酸則在MTHFR催化下重新生成甲基四氫葉酸。本研究顯示，各組MTR和CBS表達(dá)沒有差異，此外普通飼料組與低鉛染毒普通飼料組MTHFR表達(dá)無差異，而高脂飼料組和低鉛染毒高脂飼料組MTHFR表達(dá)低于普通飼料組，同時(shí)低鉛染毒高脂飼料組也明顯低于高脂飼料組，這提示在大鼠攝入高脂飼料的同時(shí)給予低鉛染毒可以造成大鼠Hcy升高，其升高與MTHFR的表達(dá)異常相關(guān)。

肝細(xì)胞的炎癥狀態(tài)與CBS、MTR和MTHFR有直接關(guān)系[11]。在肝臟炎癥發(fā)生的過程中，TNF-α是直接調(diào)控因子，TNF-α可直接活化IL-1α和IL-1β，此外TNF-α可激活肝臟Kupffer細(xì)胞，促進(jìn)IL-6釋放[12]。肝臟炎癥反應(yīng)發(fā)生后，可反作用刺激肝臟細(xì)胞，進(jìn)而誘發(fā)Hcy代謝酶分泌異常，最終導(dǎo)致Hcy升高[13]。本研究結(jié)果顯示，相較于普通飼料組，低鉛染毒普通飼料組大鼠血清中IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α并沒有明顯升高。而與普通飼料組和低鉛染毒普通飼料組相比，高脂飼料組和低鉛染毒高脂飼料組IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α明顯升高。相較于高脂飼料組，低鉛染毒高脂飼料組IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α明顯升高，這提示低鉛染毒不會(huì)對(duì)正常大鼠炎癥因子和血清Hcy升高有促進(jìn)作用，而在肝臟損傷后，則會(huì)明顯升高Hcy和炎癥反應(yīng)。

綜上所述，低鉛染毒對(duì)NAFLD大鼠Hcy升高有明顯促進(jìn)作用，這與低鉛攝入可增加肝臟炎癥反應(yīng)，降低肝臟中MTHFR表達(dá)有關(guān)。