，秦佳星 ，王秀偉 ，官臻 ，牛勃，郭金，王建華，鐘儒剛

（1.北京工業(yè)大學(xué) 環(huán)境與病毒腫瘤學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100124；2.首都兒科研究所 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究室，北京 100020）

肌醇多聚磷酸5-磷酸酶（INPP5E）基因編碼INPP5E蛋白，該基因敲除后小鼠出現(xiàn)無(wú)腦和露腦的神經(jīng)管缺陷（neural tube defects,NTD）表型[1-3]。NTD為胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天畸形，是環(huán)境因素與遺傳因素復(fù)雜交互作用的結(jié)果，環(huán)境因素包括母體營(yíng)養(yǎng)、地理及社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況等，而母體葉酸（folic acid,FA）與NTD的發(fā)生密切相關(guān)[4-8]。FA在體內(nèi)以四氫葉酸的形式參與一碳單位的代謝，與DNA甲基化過(guò)程等表觀遺傳修飾相關(guān)。本研究通過(guò)FA缺乏NTD小鼠模型，研究該基因影響胚胎神經(jīng)管閉合的分子機(jī)制，為NTD的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物7～8 周體重 18～20 g 的無(wú)特定病原體級(jí)C57BL/6J成年健康雌鼠20只（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）。在20～24℃恒溫、40%～60%恒濕的條件下，鼠繁殖飼料喂養(yǎng)（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），常規(guī)飲水，自由取食。動(dòng)物房中不定時(shí)提供食物和水。本研究已獲得首都兒科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：DWLL2016004）。

1.1.2 試劑和儀器兔源甘油醛 -3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）、INPP5E單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），蛋白上樣緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)公司），脫脂奶粉（美國(guó)BD Difco 公司），預(yù)染 Marker（美國(guó) Thermo Scientific公司），30%聚丙烯酰胺（上海碧云天生物技術(shù)公司），一步法動(dòng)物組織活性蛋白提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司），DNA提取純化試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司），DNA修飾試劑盒（美國(guó)Chemicon公司）。EG1150石蠟包埋機(jī)（德國(guó)Leica公司），Model200/2.0蛋白質(zhì)電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司），221BR Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell（美國(guó) Bio-Rad 公司），Image Quant LAS 4000mini（美國(guó)General Electric 公司），酶標(biāo)儀（美國(guó) Perkin Elmer公司），7500實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）儀（美國(guó)Applied Biosystems公司），多用凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司）等。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型及標(biāo)本采集雌鼠體重達(dá) 20 g 后，與雄鼠合籠過(guò)夜（18:00至次日6:00），次日觀察是否出現(xiàn)陰栓，出現(xiàn)陰栓可認(rèn)為12:00時(shí)為胚胎發(fā)育第0.5天。

取16只孕鼠，在胚胎發(fā)育第7.5天時(shí)隨機(jī)分為對(duì)照組和NTD組進(jìn)行處理，每組8只。對(duì)照組腹腔注射0.9%氯化鈉NaCl，NTD組采用腹腔注射4.5 mg/kg甲氨蝶呤，干擾FA代謝從而復(fù)制NTD小鼠模型[9-10]。在胚胎發(fā)育第11.5天頸部脫臼處死小鼠，取胚胎，體視顯微鏡下觀察胚胎畸形情況。

1.2.2 蘇木精 - 伊 紅（hematoxylin-eosin staining,HE）染色 將胚胎固定于100 g/L 甲醛溶液中，在乙醇溶液中脫水，在二甲苯溶液中浸泡，之后放入石蠟嵌入包埋，將石蠟塊用組織切片機(jī)進(jìn)行神經(jīng)管組織部位切片，厚度為5 mm，將切片放入二甲苯和乙醇溶液中脫蠟，隨后放入蘇木精染色液中約10 min，水沖洗后用伊紅液浸染3 min，再置于水中洗去浮色。

1.2.3 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法取 20 ml小鼠血漿，加入1.0 g活性炭，冰上輕柔攪拌1 h，4℃、20 000 r/min 離心 5 min，上清為無(wú) FA 小鼠血漿結(jié)合酶，分裝儲(chǔ)存于-70℃?zhèn)溆?。?1.5天用提取緩沖液對(duì)對(duì)照組及NTD組小鼠胚胎神經(jīng)組織樣品進(jìn)行勻漿。100℃加熱提取 15 min，20 000 r/min 離心 15 min，在上清中加入血漿結(jié)合酶，將多聚谷氨酸FA分解為小分子的單谷氨酸FA，37℃孵育1.5 h后100℃加熱5 min，20 000 r/min 離心 20 min，用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)上清液。

1.2.4 重亞硫酸鹽測(cè)序法在兩組小鼠胚胎發(fā)育第11.5天采用重亞硫酸鹽測(cè)序法檢測(cè)胚胎神經(jīng)組織中INPP5E基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平。使用DNA提取純化試劑盒提取基因組DNA于-20℃保存。NTD組DNA采用DNA修飾試劑盒進(jìn)行重亞硫酸鹽處理，將NTD組中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變成尿嘧啶（U），PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶（T），反之發(fā)生甲基化的C無(wú)變化。利用UCSC在線查詢INPP5E基因 CpG 島，使用 Methyl Primer Express V1.0軟件設(shè)計(jì)重亞硫酸鹽測(cè)序法引物，正向引物：5’-GGTTTAGTTATTGGGAAGGAGT-3’，反向引物：5’-AAATTAAACAAAATTAAATCCACCAAA-3’。 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為328 bp，共檢測(cè)該區(qū)域8個(gè)CpG甲基化位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系為50μl，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 10 min，95℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，在300 mm紫外燈下觀察結(jié)果，凝膠成像分析系統(tǒng)記錄處理數(shù)據(jù)，純化后經(jīng)Sanger法測(cè)序，使用BiQ Analyzer軟件進(jìn)行分析，將C信號(hào)的峰高與C+T信號(hào)的峰高進(jìn)行比較，來(lái)定量每個(gè)CpG二核苷酸位點(diǎn)中的甲基化水平。

1.2.5 Westernblotting 通過(guò) Western blotting 檢測(cè)INPP5E蛋白的相對(duì)表達(dá)量。在胚胎發(fā)育第11.5天對(duì)發(fā)育正常小鼠胚胎及發(fā)育缺陷小鼠胚胎進(jìn)行解剖，收集神經(jīng)組織，用CelLytic MT蛋白裂解液提取正常胚胎神經(jīng)組織總蛋白，使用布拉德福德光譜蛋白質(zhì)法測(cè)蛋白含量。對(duì)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后取下凝膠，進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，電轉(zhuǎn)移后的聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride,PVDF）在10%脫脂牛奶中室溫輕搖，封閉1.5 h。將PVDF放入玻璃皿內(nèi)，加入一定體積稀釋的I抗（1∶1 000），4℃過(guò)夜。之后用抗鼠II抗（1∶2 000）室溫孵育2 h。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液ECL顯色，使用影像處理軟件分析，GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.2.6 qRT-PCR采用qRT-PCR檢測(cè)兩組胚胎發(fā)育第11.5天小鼠胚胎神經(jīng)組織中INPP5EmRNA的相對(duì)表達(dá)量。20μl PCR 反應(yīng)液 ：SYBR? Premix DimerEraser?（2×）10μl、PCR 正向引物（10μmol）0.6μl、PCR 反 向 引 物（10μmol）0.6μl、ROX 參比染料（50×）0.4μl、模板 2μl、ddH2O 6.4μl，采用序列分析和熔解曲線分析對(duì)PCR產(chǎn)物的特異性進(jìn)行檢驗(yàn)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性3 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 32 s，共 40個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸 34 s。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠胚胎表型及 HE 染色結(jié)果

對(duì)照組小鼠胚胎發(fā)育第11.5天胚胎外觀較為飽滿圓滑，頭部前、中及后腦泡均已經(jīng)發(fā)育形成，脊柱表面完整無(wú)裂口（見(jiàn)圖1A）；可見(jiàn)明顯的耳泡、眼泡，尾部彎曲細(xì)長(zhǎng)。HE染色顯示神經(jīng)管發(fā)育良好，細(xì)胞排列密集整齊（見(jiàn)圖1B、C）。

NTD組小鼠胚胎的后腦部位神經(jīng)管未閉合，神經(jīng)組織裸露在胚胎外（見(jiàn)圖1D）。HE染色顯示后腦頂板未閉合，神經(jīng)腔面未完整，且細(xì)胞排列疏松（見(jiàn)圖1E、F）。

2.2 兩組小鼠胚胎一般資料比較

兩組胚胎的頂臀長(zhǎng)度比較，采用t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=24.480，P=0.002），NTD組短于對(duì)照組。兩組胚胎的體重比較，采用t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=41.860，P=0.001），NTD組低于對(duì)照組。兩組胚胎畸形率比較，采用Fisher確切概率法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。見(jiàn)表1。

2.3 兩組INPP5E基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平比較

在引物擴(kuò)增的328 bp區(qū)域中，包含8個(gè)CpG二核苷酸。對(duì)照組與NTD組CpG甲基化水平分別為40.6%和9.4%，NTD組與對(duì)照組甲基化程度的比率為23.2%。兩組INPP5E基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平比較，采用χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=33.330，P=0.000），NTD組低于對(duì)照組。見(jiàn)圖2。

圖1 兩組小鼠胚胎發(fā)育第11.5天的胚胎表型及HE染色結(jié)果

表1 兩組胚胎一般資料比較

圖2 INPP5E 基因 CpG 島的甲基化

2.4 兩組小鼠胚胎組織中INPP5E相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)照組和NTD組小鼠胚胎發(fā)育第11.5天時(shí)INPP5E蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（1.000±0.230）和（0.482±0.080），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.981，P=0.027），NTD組低于對(duì)照組。對(duì)照組和NTD組INPP5E mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（1.000±0.117）和（0.623±0.034），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.867，P=0.016），NTD組低于對(duì)照組。NTD組小鼠胚胎神經(jīng)組織中，INPP5E基因啟動(dòng)子區(qū)的低甲基化可能是引起INPP5E mRNA表達(dá)降低的原因，從而影響胚胎神經(jīng)管的發(fā)育。見(jiàn)圖3、4。

2.5 兩組小鼠胚胎神經(jīng)組織中FA及其相關(guān)代謝產(chǎn)物水平比較

在最佳的超高效液相色譜條件下分離檢測(cè)FA及其相關(guān)代謝產(chǎn)物5-甲基四氫FA（5-methyltetrahydrofolate,5-MeTHF）、5- 甲酰四氫 FA（5-formyltetrahydrofolate,5-FoTHF）和同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）水平，分別在2.82、2.53、2.88和0.71 min被洗脫，進(jìn)一步通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行定量分析。見(jiàn)圖4。

圖3 兩組小鼠胚胎組織中 INPP5E 蛋白和mRNA 表達(dá)水平比較（n =8，±s）

圖4 FA及其相關(guān)代謝產(chǎn)物質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖

FA在對(duì)照組及NTD組中的含量分別為（2.76±0.98）和（4.39±1.41）mg/g，5-MeTHF的含量分別為（9.55±2.38）和（4.62±1.98）mg/g，5-FoTHF的含量分別為（4.86±1.02）和（3.19±0.75）mg/g，Hcy的含量分別為（4.33±1.42）和（7.06±1.38）mg/g。兩組小鼠胚胎神經(jīng)組織中FA、5-MeTHF、5-FoTHF及Hcy水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.566、21.350、10.710 和118.200，P=0.022、0.002、0.009和0.000），NTD組小鼠胚胎神經(jīng)組織中FA和Hcy水平高于對(duì)照組，NTD組小鼠胚胎神經(jīng)組織中5-MeTHF和5-FoTHF水平低于對(duì)照組。見(jiàn)圖5。

圖5 兩組小鼠胚胎神經(jīng)組織中FA及其相關(guān)代謝產(chǎn)物水平比較（n =8，±s）

3 討論

INPP5E基因調(diào)節(jié)肌醇信號(hào)通路活性，參與胚胎神經(jīng)發(fā)育，其編碼的INPP5E蛋白存在于神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞骨架、纖毛軸絲、高爾基體、高爾基體膜、外周膜蛋白及質(zhì)膜內(nèi)側(cè)[11-14]。有研究發(fā)現(xiàn)，INPP5E基因突變導(dǎo)致茹貝爾綜合征等疾病[15-17]。有研究顯示，INPP5E基因表達(dá)影響初級(jí)纖毛穩(wěn)定性，進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)管的閉合[18-20]。有學(xué)者報(bào)道INPP5E基因突變與神經(jīng)管畸形相關(guān)，神經(jīng)管畸形是纖毛相關(guān)疾病的主要表型之一，是一種嚴(yán)重的出生缺陷，是由多種因素導(dǎo)致的神經(jīng)管部分或完全閉合不全，進(jìn)而影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[21]。INPP5E基因突變會(huì)引起PI（3，4，5）P3和PI（4，5）P2的生成產(chǎn)物減少，并通過(guò)改變PI3K信號(hào)通路影響細(xì)胞增殖、存活、凋亡及初級(jí)纖毛穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致后腦畸形及纖毛相關(guān)疾病[22-25]。

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，參與基因表達(dá)調(diào)控，影響胚胎生長(zhǎng)發(fā)育[26]。低甲基化的DNA在有絲分裂中易發(fā)生重組，導(dǎo)致基因發(fā)生缺失或易位，最終影響基因表達(dá)[27]。有研究報(bào)道NTD小鼠胚胎中，與細(xì)胞增殖相關(guān)的Ptch1、Pla2g4a、Foxgl基因的甲基化水平與對(duì)照組相比顯著降低，且qRT-PCR結(jié)果與甲基化水平改變相關(guān)，推測(cè)甲基化的改變?cè)贜TD發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[28]。本研究采用腹腔注射4.5 mg/kg甲氨蝶呤，干擾FA代謝從而復(fù)制NTD小鼠模型，通過(guò)檢測(cè)對(duì)照組及NTD組小鼠胚胎中的FA及其代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)NTD組小鼠胚胎神經(jīng)組織的FA含量明顯升高，且代謝產(chǎn)物5-MeTHF和5-FoTHF的含量明顯降低，說(shuō)明此時(shí)FA代謝呈現(xiàn)紊亂趨勢(shì)；INPP5E基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的顯著降低，推測(cè)FA代謝失衡引起甲基化供體不足，導(dǎo)致INPP5E基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平顯著降低，從而影響該基因的正常表達(dá)，干擾神經(jīng)管的閉合。以上結(jié)果表明在神經(jīng)發(fā)育早期，需要INPP5E基因在一定水平上表達(dá)調(diào)控神經(jīng)管正常閉合。

本研究發(fā)現(xiàn)NTD小鼠胚胎INPP5E蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量低于正常小鼠。說(shuō)明INPP5E基因在發(fā)育早期影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，本研究結(jié)果表明NTD小鼠胚胎神經(jīng)組織的INPP5E蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量下降，參與FA代謝紊亂神經(jīng)管閉合失敗，造成小鼠露腦畸形。INPP5E基因表達(dá)水平的改變是否通過(guò)PI3K信號(hào)通路活性影響初級(jí)纖毛形成，其具體機(jī)制尚需在細(xì)胞內(nèi)干擾INPP5E基因的表達(dá)，如用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞上進(jìn)行INPP5E基因敲除實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，檢測(cè)PI（3，4，5）P3和PI（4，5）P2及初級(jí)纖毛的形成可進(jìn)一步研究該基因?qū)ε咛ド窠?jīng)發(fā)育的影響。

因此，INPP5E基因在調(diào)節(jié)胚胎神經(jīng)發(fā)育中起重要作用，NTD組小鼠胚胎神經(jīng)組織中該基因的表達(dá)降低，推測(cè)由于FA代謝失衡引起甲基化供體不足，使該基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生低甲基化，進(jìn)而引起基因異常表達(dá)導(dǎo)致NTD的發(fā)生。對(duì)INPP5E基因調(diào)控胚胎神經(jīng)發(fā)育分子機(jī)制的進(jìn)一步闡明，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷相關(guān)疾病的早期診斷及防控具有重要的意義。