馬 征， 焦光美， 單海雷， 張曉璇， 康玲伶， 竇志杰， 高燕軍

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 河北 承德 067000)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是多種心腦血管疾病共同的病理基礎(chǔ)，其發(fā)生涉及單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、泡沫細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞間復(fù)雜的相互作用[1-2]。大量研究表明，巨噬細(xì)胞凋亡可通過降低細(xì)胞數(shù)量、釋放膽固醇、釋放促血栓物質(zhì)等途徑促進(jìn)AS易損斑塊形成[3]，因此，抑制AS相關(guān)的巨噬細(xì)胞凋亡對其治療具有重要意義。巨噬細(xì)胞凋亡調(diào)控體系復(fù)雜，氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)等各種刺激因素均參與巨噬細(xì)胞凋亡調(diào)控過程[4]。已有研究表明，近些年發(fā)現(xiàn)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子Kruppel樣因子6(Kruppel-like factor 6，KLF6)與脂代謝和炎癥等生理病理狀態(tài)有關(guān)[5]。最新研究表明，KLF6是調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的關(guān)鍵因子之一，通過對巨噬細(xì)胞過氧化酶體增殖物激活受體γ抑制M2型抗炎因子表達(dá)[6]；也有研究指出，KLF6可通過促進(jìn)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1的表達(dá)抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞膽固醇蓄積[7]。以上研究提示KLF6可能在AS發(fā)病過程中有重要作用。本研究將重組體pcDNA3.1-KLF6轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞，旨在探討過表達(dá)KLF6對ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步研究AS的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞試劑和儀器

人單核細(xì)胞株THP-1購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)。佛波脂(phorbol myristate acetate，PMA)購自碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)及RPMI-1640培養(yǎng)液均購自Gibco；ox-LDL購自Sigma；鼠抗人KLF6抗體、鼠抗人Bcl-2抗體、鼠抗人Bax抗體和p-AKT抗體均購自CST；MTT試劑盒、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、pcDNA3.1載體及H2DCF-DA熒光探針均購自Sigma；細(xì)胞凋亡試劑盒和流式細(xì)胞儀均購自BD。酶標(biāo)儀購自Thermo。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) THP-1細(xì)胞使用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。以每孔1×105個細(xì)胞將傳4～6代的細(xì)胞接種至6孔板中，細(xì)胞生長約90%融合時，加入160 nmol/L的PMA預(yù)處理細(xì)胞24 h，將其誘導(dǎo)分化為 THP-1巨噬細(xì)胞，更換培養(yǎng)基。

2.2實驗分組 將誘導(dǎo)分化的THP-1巨噬細(xì)胞隨機分為：pcDNA3.1組，轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1；ox-LDL組，50 mg/L的ox-LDL刺激細(xì)胞24 h；ox-LDL+pcDNA3.1組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 24 h(轉(zhuǎn)染濃度100 nmol/L)，再加入50 mg/L的ox-LDL刺激24 h；ox-LDL+pcDNA3.1-KLF6組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KLF6(轉(zhuǎn)染濃度100 nmol/L) 24 h，再加入50 mg/L的ox-LDL刺激24 h,其中pcDNA3.1的轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000試劑盒說明。細(xì)胞達(dá)60%～70%生長融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。制備pcDNA3.1與脂質(zhì)體復(fù)合物，將復(fù)合物加入24孔板相應(yīng)孔內(nèi)，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，更換為含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基。各組細(xì)胞處理24 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

2.3Western blot實驗 細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒對蛋白濃度定量，制備5%濃縮膠及12%分離膠。將蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，100 ℃變性5 min。每孔道上樣40 μg變性蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)PVDF膜及封閉膜后，4 ℃孵育 I 抗過夜(KLF6、Bcl-2、Bax和p-AKT抗體，1∶1 000)，洗膜，加HRP標(biāo)記的羊抗鼠 II 抗(1∶3 000)，37 ℃孵育1 h，ECL顯色，暗室中顯影、定影。Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析。實驗重復(fù)3次。

2.4細(xì)胞活力的檢測 接種巨噬細(xì)胞于96孔板，每孔200 μL細(xì)胞懸液(每孔5×103個)，于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)70%～80%貼壁融合時，將培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液吸棄，含2% FBS培養(yǎng)液靜置24 h，使用pcDNA3.1、ox-LDL、ox-LDL+pcDNA3.1和ox-LDL+pcDNA3.1-KLF6處理細(xì)胞，24 h后，每孔中加MTT液(5 g/L) 20 μL，于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)孵育4 h，吸去上清，在每孔中加DMSO 150 μL，在振蕩器上振蕩混勻，使結(jié)晶溶解充分。酶標(biāo)儀測定各組490 nm波長的吸光度(A)值。每組設(shè)置5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.5細(xì)胞凋亡檢測 以Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。pcDNA3.1、ox-LDL、ox-LDL+pcDNA3.1和ox-LDL+pcDNA3.1-KLF6處理巨噬細(xì)胞24 h后，PBS洗滌細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，分別加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，室溫避光反應(yīng)15～20 min，上機前加200 μL 1×緩沖液，通過流式細(xì)胞儀檢測(1 h內(nèi))。實驗重復(fù)3次。

2.6活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平的檢測 使用H2DCF-DA探針檢測。pcDNA3.1、ox-LDL、ox-LDL+pcDNA3.1和ox-LDL+pcDNA3.1-KLF6處理巨噬細(xì)胞24 h后，每孔加終濃度10 μmol/L的H2DCF-DA，常規(guī)孵育20 min，用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的熒光強度。實驗重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 KLF6在巨噬細(xì)胞的表達(dá)

參照LipofectamineTM2000試劑盒說明，將重組體pcDNA3.1-KLF6轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞，通過Western blot檢測轉(zhuǎn)染后的巨噬細(xì)胞KLF6蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KLF6的巨噬細(xì)胞中KLF6的蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1組KLF6的蛋白表達(dá)與空白(blank)組差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖1。

Figure 1. Western blot was used to determine the protein expression of KLF6 in the THP-1 cell-derived macrophages transfected with pcDNA3.1-KLF6. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖1 Western blot檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KLF6的巨噬細(xì)胞中KLF6的表達(dá)

2 過表達(dá)KLF6對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活力的影響

各組細(xì)胞處理24 h，通過MTT法檢測各組細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，ox-LDL可明顯降低巨噬細(xì)胞的活力，而過表達(dá)KLF6可減弱ox-LDL對巨噬細(xì)胞活力的抑制作用(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The effects of KLF6 over-expression on macrophage viability induced by ox-LDL. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspcDNA3.1 group;#P<0.05vsox-LDL+pcDNA3.1 group.

圖2 過表達(dá)KLF6對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活力的影響

3 過表達(dá)KLF6對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡的影響

使用Annexin V-FITC/PI雙染法，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率變化，結(jié)果顯示,ox-LDL可明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡，而過表達(dá)KLF6可減弱ox-LDL對巨噬細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用(P<0.05)，見圖3。

4 過表達(dá)KLF6對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞ROS水平的影響

使用H2DCF-DA探針檢測各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化，結(jié)果顯示，ox-LDL可明顯誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，而過表達(dá)KLF6可減弱ox-LDL對巨噬細(xì)胞ROS產(chǎn)生的誘導(dǎo)作用(P<0.05)，見圖4。

5 過表達(dá)KLF6對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

通過Western blot檢測各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)，結(jié)果顯示，ox-LDL可明顯下調(diào)巨噬細(xì)胞Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，而過表達(dá)KLF6可減弱ox-LDL對Bcl-2表達(dá)下調(diào)及Bax表達(dá)上調(diào)的作用(P<0.05)，見圖5。

6 過表達(dá)KLF6對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞AKT信號通路的影響

通過Western blot檢測各組細(xì)胞p-AKT的蛋白水平，結(jié)果顯示，ox-LDL可明顯下調(diào)巨噬細(xì)胞p-AKT的蛋白水平，而過表達(dá)KLF6可減弱ox-LDL對細(xì)胞p-AKT蛋白水平下調(diào)的作用(P<0.05)，見圖6。

Figure 3. The effects of KLF6 over-expression on macrophage apoptosis induced by ox-LDL. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspcDNA3.1 group;#P<0.05vsox-LDL+pcDNA3.1 group.

圖3 過表達(dá)KLF6對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4. The effects of KLF6 over-expression on ROS production level in the macrophages induced by ox-LDL. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspcDNA3.1 group;#P<0.05vsox-LDL+pcDNA3.1 group.

圖4 過表達(dá)KLF6對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞ROS生成水平的影響

討 論

AS是多種心血管疾病的重要病因，巨噬細(xì)胞在AS發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[8]。ox-LDL是低密度脂蛋白經(jīng)超氧陰離子、金屬離子或其它致氧因子作用形成的，對AS過程中炎癥因子釋放有促進(jìn)作用，并可促進(jìn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的粥樣斑塊降解，其水平與AS嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[9]。有研究表明，ox-LDL低濃度可抑制生長因子引起的巨噬細(xì)胞凋亡，其機制與激活PI3K/AKT信號通路有關(guān)，而ox-LDL高濃度可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞凋亡，甚至死亡[10]。已有研究表明，<50 mg/L ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡不明顯，而50 mg/L ox-LDL可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。因此，本研究選擇50 mg/L ox-LDL處理巨噬細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型。

KLF6是KLF家族成員之一，是一類有鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，可通過對下游基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控參與細(xì)胞增殖、凋亡、生長發(fā)育、血管生成、分化等生理和病理過程[12]。已有多項研究表明，KLF6與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是一個抑癌基因[13-14]。近年來的研究表明，KLF家族成員與AS形成存在密切關(guān)系，如KLF2在AS病變的多種細(xì)胞中，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控多種因子，達(dá)到抗炎、防治血栓、抗凝和抗氧化等作用[15]。已有研究表明，KLF6可通過促進(jìn)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1表達(dá)，抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞膽固醇蓄積[7],提示KLF6在AS發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用。本研究旨在探討過表達(dá)KLF6對THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)分化的的巨噬細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，過表達(dá)KLF6可明顯提高ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的活力，降低細(xì)胞凋亡率，提示過表達(dá)KLF6可能減輕AS的損傷作用。

Figure 5. The effects of KLF6 over-expression on the protein expression of Bcl-2 and Bax in the macrophages induced by ox-LDL. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspcDNA3.1 group;#P<0.05vsox-LDL+pcDNA3.1 group.

圖5 過表達(dá)KLF6對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

Figure 6. The effects of KLF6 over-expression on the AKT signaling pathway in the macrophages induced by ox-LDL. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspcDNA3.1 group;#P<0.05vsox-LDL+pcDNA3.1 group.

圖6 過表達(dá)KLF6對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞AKT信號通路的影響

當(dāng)機體受到各種刺激源時，可引起氧化與抗氧化失衡，引起ROS的大量產(chǎn)生，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織損傷[16]。已有大量研究表明，氧化應(yīng)激在AS、糖尿病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用[17-18]。有研究表明，ox-LDL可明顯促進(jìn)AS相關(guān)的巨噬細(xì)胞ROS產(chǎn)生[19]。本研究使用50 mg/L ox-LDL處理巨噬細(xì)胞，ROS水平升高，這與既往研究結(jié)果一致；而過表達(dá)KLF6可明顯降低ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，提示降低ROS水平可能是KLF6降低巨噬細(xì)胞凋亡的機制之一。

AKT是PI3K/AKT信號通路的中心環(huán)節(jié)，生長因子和細(xì)胞因子等均可通過激活PI3K使磷酸化AKT活化，而AKT活化后可通過引起下游靶蛋白和磷酸化級聯(lián)反應(yīng)相互作用，從而調(diào)控細(xì)胞生長、增殖和凋亡等生物學(xué)過程[20-21]。AKT調(diào)控細(xì)胞凋亡與凋亡相關(guān)的Bcl-2家族密切相關(guān)，Bcl-2和Bax分別為該家族的抑凋亡基因和促凋亡基因，下調(diào)Bcl-2或上調(diào)Bax均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22-23]。已有研究表明，AKT信號通路在巨噬細(xì)胞凋亡中有重要作用，激活A(yù)KT信號可明顯抑制細(xì)胞凋亡，而抑制該信號則促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24-25]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)KLF6可明顯上調(diào)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞Bcl-2和p-AKT的蛋白水平，下調(diào)Bax表達(dá)。提示KLF6對AS相關(guān)的巨噬細(xì)胞凋亡與激活A(yù)KT信號通路有關(guān)。

綜上所述，KLF6基因可明顯提高ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡，機制可能與降低細(xì)胞ROS水平及激活PI3K/AKT信號通路有關(guān)。本實驗結(jié)果提示KLF6可能是AS治療的分子靶點之一。本研究僅檢測了KLF6對巨噬細(xì)胞活力和凋亡的影響，其他生物學(xué)特性及機制尚未涉及，后續(xù)將進(jìn)一步加以探討。