杜海濤，孫鐵鋒，王 平2，?，韓 莉，王燕玲，呂 琪

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.天津大學(xué)精密測(cè)試技術(shù)及儀器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072；3.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014；4.山東省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014）

呼吸道合胞病毒（RSV）為副黏病毒科、肺炎病毒屬單股負(fù)鏈RNA 病毒，是引起呼吸道感染最常見的病原之一［1］。因其引起呼吸道組織培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生融合性病變，故命名呼吸道合胞病毒［2］。最早在1956 年從圈養(yǎng)的黑猩猩體內(nèi)分離出，1957 年從下呼吸道感染的嬰兒呼吸道分離出同樣的病毒。流行病學(xué)調(diào)查顯示，RSV 通過接觸或空氣傳播，每年冬春季節(jié)在亞熱帶、溫帶地區(qū)大規(guī)模流行，易感人群為嬰幼兒和老年人，感染后不會(huì)形成特異性免疫，患者愈后有再次感染的風(fēng)險(xiǎn)［3-4］。WHO 估算，全球每年有6 400萬左右兒童感染RSV，其中16 萬左右死于RSV 感染，給患者及其家庭帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)與心理負(fù)擔(dān)［5］。

RSV 感染現(xiàn)狀嚴(yán)峻，現(xiàn)在仍無上市的疫苗可用［6-7］?？筊SV 代表性西藥利巴韋林、帕利珠單抗因不良反應(yīng)較多，臨床應(yīng)用存在爭(zhēng)議，僅用于治療高風(fēng)險(xiǎn)患者［8］。中藥在預(yù)防和治療病毒感染性疾病有著悠久歷史和豐富經(jīng)驗(yàn)，在體內(nèi)外治療中均表現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，開發(fā)應(yīng)用前景廣闊。如何從傳統(tǒng)清熱藥中尋找抗RSV 新藥成為新趨勢(shì)，近年來相關(guān)課題研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展。本文將從清熱藥概況、RSV 生物學(xué)特性、清熱藥抗RSV 主要活性成分研究進(jìn)展、清熱藥抗RSV 感染機(jī)制總結(jié)、清熱藥抗RSV 篩選思路等方面進(jìn)行綜述，旨在為從清熱藥中優(yōu)化出抗RSV 的藥物提供參考。

1 清熱藥概況

以清瀉里熱為主要作用的藥物稱為清熱藥，其藥性寒涼，具有清熱瀉火、解毒、清虛熱等功效，多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮作用。文獻(xiàn)研究（表1）表明，具有抗RSV 活性藥物集中于清熱解毒藥和清熱燥濕藥，清熱復(fù)方多以清熱藥作為君藥（表2）。由于各種藥所含抗病毒活性成分不同，因此其抗病毒作用靶點(diǎn)也各具針對(duì)性，各味藥配伍后也會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用，常常會(huì)通過多角度抑制和消滅RSV，清熱復(fù)方具有多層次的抗病毒作用。

2 RSV 生物學(xué)特性

抗RSV 的藥物需要針對(duì)RSV 的特性或作用靶標(biāo)。RSV是非節(jié)段、負(fù)鏈線性RNA 病毒，有A 和B 2 個(gè)亞型，有1個(gè)15 kb 單鏈，含10 個(gè)基因，能編碼11 種蛋白質(zhì)［9］。RSV結(jié)構(gòu)由包膜、核衣殼、核心組成，包膜有黏附蛋白G、融合蛋白F、疏水蛋白SH 3 種主要跨膜糖蛋白。

G 蛋白可與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合，介導(dǎo)RSV 與細(xì)胞接觸發(fā)生感染。G 蛋白是最易發(fā)生抗原變異的包膜糖蛋白，能發(fā)生蛋白核苷酸變異也使其氨基酸發(fā)生變異，RSV 2 種亞型抗原型的不同主要表現(xiàn)在G 蛋白上。RSV不會(huì)形成終生免疫，也與G 蛋白抗原變異逃過宿主免疫識(shí)別密切相關(guān)［10］。有研究發(fā)現(xiàn)［11］中藥有效成分具有G蛋白識(shí)別區(qū)域類似結(jié)構(gòu)，可與RSV 結(jié)合，從而阻止其黏附于宿主細(xì)胞。

F 蛋白主要參與病毒與細(xì)胞的融合，可使病毒包膜與宿主細(xì)胞膜融合形成合胞體，并能誘導(dǎo)宿主的體液免疫和細(xì)胞免疫［12］。與G 蛋白相比，F(xiàn) 蛋白具有高保守性，誘導(dǎo)的中和抗體可以同時(shí)抑制A、B 兩個(gè)亞型的病毒感染，因此成為抗病毒藥物開發(fā)的理想靶標(biāo)［13-14］。有研究發(fā)現(xiàn)［15］忍冬科植物提取物3，4-DCQAME 可通過阻斷F 蛋白與細(xì)胞膜的結(jié)合從而抑制RSV 與細(xì)胞膜的融合，起到阻斷RSV 進(jìn)入宿主細(xì)胞的作用，進(jìn)而推測(cè)清熱忍冬科藥物金銀花、忍冬藤具有直接抑制F 蛋白發(fā)揮作用的功效。

表1 抗RSV 相關(guān)清熱藥及成分

表2 抗RSV 清熱藥復(fù)方

SH 蛋白的功能尚不明確，但研究發(fā)現(xiàn)SH 蛋白可能與RSV 引發(fā)的炎癥和免疫反應(yīng)相關(guān)［16］。

RSV 入侵過程必須靠G 蛋白附著至宿主細(xì)胞表面，再由F 蛋白介導(dǎo)其膜與宿主細(xì)胞膜融合，將病毒基因組傳遞到細(xì)胞內(nèi)才能引發(fā)感染。跨膜糖蛋白與入侵過程息息相關(guān)，因此F 蛋白是目前疫苗和西藥抗病毒藥物開發(fā)的主要靶點(diǎn)，也是中藥相關(guān)研究的中藥靶點(diǎn)。

3 清熱藥抗RSV 主要活性成分研究進(jìn)展

清熱藥治療肺系疾病歷史悠久，為探尋抗RSV 新藥提供了豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)，研究表明清熱藥主要通過直接和間接兩種途徑發(fā)揮抗RSV 作用［17］。直接途徑指清熱藥物成分直接作用于病毒，使黏附、入侵、融合或繁殖的某一環(huán)節(jié)受阻或抑制；間接途徑指清熱藥物成分調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，通過影響免疫受體、免疫細(xì)胞等的活性進(jìn)一步清除病毒。近年來，諸多學(xué)者針對(duì)不同的臨床病例和實(shí)驗(yàn)對(duì)各種清熱藥抗RSV 感染的活性成分進(jìn)行了探討，初步篩選出部分抗RSV 的有效藥。

3.1 單味藥及其提取成分 梔子具有清熱利濕、涼血解毒之功效，屬清熱瀉火藥，梔子苷是從梔子中分離得到的一種環(huán)烯醚萜苷，具有抗哮喘、抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒等藥理作用［18］。Wang 等［19］報(bào)道了梔子苷可以通過MyD88 和NF-κB p65 起抗炎作用；王意忠等［20］采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，利用CPE 法觀察梔子提取物ZG 對(duì)RSV 等6 種呼吸道病毒致細(xì)胞病變的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，體外抗病毒試驗(yàn)中，梔子提取物ZG 對(duì)RSV、甲型流感病毒等所致細(xì)胞病變有明顯抑制作用。

黃芩中的黃酮類化合物具有抗感染、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。Hou［21］實(shí)驗(yàn)證明黃芩苷可通過抑制TLR4 信號(hào)通路相關(guān)因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和相關(guān)mRNA 起抗炎作用；張沛等［22］研究黃芩苷對(duì)RSV 感染大鼠肺組織Ⅰ型干擾素（Ⅰ-IFN）及SOCS1／3 蛋白的干預(yù)作用，發(fā)現(xiàn)黃芩苷可上調(diào)RSV 感染大鼠體內(nèi)Ⅰ-IFN 的表達(dá)，并可能通過下調(diào)IL-6 和IL-12 的水平來抑制SOCS1／3的表達(dá)，從而可以作為單體獨(dú)立發(fā)揮抗病毒作用；云云等［23］通過體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 與黃芩苷共孵育檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與感染組相比，黃芩苷組RAW264.7 細(xì)胞的TLR4 mRNA 及蛋白的表達(dá)量明顯下降，NF-κB 活化減少，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6 水平顯著降低。

黃連提取物中含多種不同的生物堿［24］。Lee 等［25］發(fā)現(xiàn)黃連多種提取物及其成分具有免疫調(diào)節(jié)的作用，其中黃連提取物CRE 可以激活抗病毒信號(hào)分子，導(dǎo)致Ⅰ-IFN 和各種炎癥細(xì)胞因子的快速產(chǎn)生，上調(diào)抗病毒相關(guān)因子IFN-β、ISGs 和基因的轉(zhuǎn)錄水平。

Gao 等［26］研究發(fā)現(xiàn)苦參有效成分氧化槐果堿可減少RSV 感染細(xì)胞中活性氧的形成，提高了抗氧化酶的活性，從而通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥使得小鼠肺損傷明顯減輕。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氧化槐果堿抑制RSV 刺激A549 細(xì)胞產(chǎn)生和釋放促炎細(xì)胞因子和趨化因子（TNF-α、IL-6、IL-8 等）、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1），從而減輕RSV 所致炎癥。

潘玥婷等［27］分析中藥菊花煎劑干預(yù)RSV 感染氣道上皮細(xì)胞A549，發(fā)現(xiàn)菊花煎劑具有抑制病毒生長(zhǎng)復(fù)制作用，存在一定正量效應(yīng)，其原理是黃酮類成分通過抑制趨化因子RANTEs、MCP-1 的表達(dá)和釋放，從而減輕患者氣道炎癥反應(yīng)。

吳莎等［28］采用MTT 法研究穿心蓮有效成分槲皮素和穿心蓮內(nèi)酯的體外抗病毒作用，發(fā)現(xiàn)二者對(duì)已進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的RSV 起一定的抑制作用。槲皮素能夠拮抗鈣離子通道，阻斷病毒受體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞，從而中斷RSV 生活周期使其死亡，從而直接發(fā)揮抗病毒作用；穿心蓮內(nèi)酯作用于病毒RNA 與蛋白結(jié)合位點(diǎn)，使其不能正常復(fù)制，發(fā)揮直接抗病毒作用。

陸兆光等［29］通過制備青蒿揮發(fā)油HP-β-CD 包合物并進(jìn)行表征，采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法研究青蒿揮發(fā)油及其包合物抗RSV 的活性，結(jié)果顯示包合物工藝穩(wěn)定可行，能夠有效抑制RSV。包合技術(shù)在靶向給藥環(huán)節(jié)具有重要意義，提示可以從揮發(fā)油類中藥成分出發(fā)，通過霧化吸入方法進(jìn)行靶向給藥。

3.2 清熱藥復(fù)方 “藥有個(gè)性之特長(zhǎng)，方有合群之妙用”，復(fù)方配伍一直是中醫(yī)臨床用藥的最大特色。以清熱藥為主，具有清熱、瀉火、涼血、解毒等作用的方劑稱為清熱復(fù)方［30］，用藥歷史悠久，有大量經(jīng)方、驗(yàn)方基礎(chǔ)，近年來關(guān)于復(fù)方的研究一直受到高度關(guān)注和重視。在繼承經(jīng)典方的同時(shí)以新技術(shù)加以分析，探尋清熱中藥在抗病毒方面的協(xié)同作用，取得具有較好臨床療效的新中成藥，并運(yùn)用分子生物學(xué)探討和解釋復(fù)方抗病毒的干預(yù)靶點(diǎn)和機(jī)制成為研究的熱點(diǎn)。

定喘湯出自明朝《攝生眾妙方》，具平喘、止咳、化痰等功效，臨床用于治療痰熱壅肺癥。研究發(fā)現(xiàn)［31］，定喘湯能夠直接影響機(jī)體免疫系統(tǒng)功能，降低血清IgE 抗體含有量，進(jìn)一步減輕氣道對(duì)過敏原的反應(yīng)性，實(shí)現(xiàn)平喘作用。冷玲等［32］通過觀察定喘湯對(duì)RSV 感染大鼠病毒載量及細(xì)胞免疫的影響，發(fā)現(xiàn)定喘湯可有效降低RSV 感染大鼠肺組織病毒載量，對(duì)外周血免疫抑制細(xì)胞具有良好的調(diào)節(jié)作用；李含章等［33］研究定喘湯對(duì)RSV 感染型肺炎患者免疫、炎癥因子的影響，發(fā)現(xiàn)治療后觀察組CD3+、CD8+、NK、INF-γ 水平均高于對(duì)照組，CD4+／CD8+、IL-4、IL-6、IL-8水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Li 等［34］報(bào)道定喘湯在RSV 感染過程中起到抑制炎癥介質(zhì)及NF-κB 和TLR4抑制劑的作用，且毒性較小，說明定喘湯能有效調(diào)節(jié)炎癥和相關(guān)免疫反應(yīng)，對(duì)RSV 所致肺炎有良好治療作用。

退熱解毒靈是張介眉教授的經(jīng)驗(yàn)方，含連翹、板藍(lán)根、野菊花3 味清熱藥，具有解熱、抗炎、抗病毒之功效［35］，能有效縮短病程。蘇文等［36］體外研究證實(shí)退熱解毒靈水煎劑對(duì)RSV 的增殖有明顯的抑制作用，可兼顧抑制病毒和免疫調(diào)節(jié)，通過上調(diào)IL-10、IFN-γ、IL-2 的表達(dá)，下調(diào)MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-1β 的表達(dá)，從而發(fā)揮抗RSV 作用，減輕病毒對(duì)肺組織的直接損傷，治療指數(shù)大于病毒唑。

金欣口服液（原名清肺口服液）是汪受傳教授根據(jù)小兒病毒性肺炎的病機(jī)特點(diǎn)，并結(jié)合數(shù)年臨床經(jīng)驗(yàn)及現(xiàn)代藥理研究后總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)方，方中含生石膏、黃岑等清熱藥，臨床用于治療小兒RSV 肺炎痰熱閉肺證療效較好，易于被患兒接受。金欣口服液含藥血清能夠下調(diào)TLR4 表達(dá)，使得相關(guān)炎癥因子水平降低［37］；范奕熳等［38-39］研究清肺口服液抗RSV 感染所致肺炎的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)與模型組相比，藥物干預(yù)組IL-10 及體外實(shí)驗(yàn)中含藥血清SATA5 水平升高，趨于正常，T 細(xì)胞亞群失衡被糾正，提示清肺口服液可通過上調(diào)SATA5 和IL-10 達(dá)到抗炎抗病毒功效；張沛等［40-41］研究金欣口服液對(duì)RSV 感染大鼠體內(nèi)相關(guān)蛋白的調(diào)控趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)它可直接上調(diào)磷酸化STAT 表達(dá)，激活JAK-STAT信號(hào)通路，下調(diào)SOCS1／3 表達(dá)，從而介導(dǎo)Ⅰ-IFN 發(fā)揮抗RSV 效應(yīng)。

熱毒寧為中藥復(fù)方注射液，由梔子、青蒿、金銀花3味清熱藥精制而成，具有清熱、疏風(fēng)、解毒功效［42］。李海波等［43］對(duì)熱毒寧分離得到的化合物進(jìn)行體外抗RSV 作用研究，發(fā)現(xiàn)10 種咖啡?？鼘幩犷愌苌锞哂休^好的抗RSV活性。

中藥復(fù)方大多間接通過作用于免疫系統(tǒng)Toll 樣受體或細(xì)胞因子，提高機(jī)體免疫能力，兼有一定的直接清除病毒的能力，二者相輔相成，根據(jù)經(jīng)方、驗(yàn)方特點(diǎn)開發(fā)出耐儲(chǔ)存、攜帶方便的新劑型具有較高的可行性。

4 清熱藥抗RSV 感染機(jī)制總結(jié)

早期對(duì)中藥抗RSV 的研究思路是從體內(nèi)外感染模型進(jìn)行藥物干預(yù)以評(píng)價(jià)藥效，主要進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（CPE 法、MTT 法等）、動(dòng)物（小鼠、雞胚等）實(shí)驗(yàn)等，以抗病毒相關(guān)指標(biāo)量化藥物，并沒有真正有效解釋藥物抗病毒的機(jī)制。近年來隨著實(shí)時(shí)熒光定量法（RT-PCR）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）等檢測(cè)手段的提高，以及代謝組學(xué)、基因組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展，對(duì)清熱藥抗RSV 機(jī)制的研究已經(jīng)逐漸深入到分子水平，但仍面臨對(duì)應(yīng)研究面較窄的問題，研究程度有待進(jìn)一步加深。

4.1 清熱藥成分改變RSV 蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)揮直接抑制作用 清熱藥中的成分可以與RSV 表面糖蛋白結(jié)合，使其蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致其無法黏附、進(jìn)入人體細(xì)胞，甚至穿透其外膜，影響RSV 核酸的復(fù)制與表達(dá)。楊潔等［44］采用觀察細(xì)胞病變（CPE）和活細(xì)胞染色計(jì)數(shù)法（MTT），證實(shí)黃芩提取物及其含藥血清體外具有抑制RSV 在Hep-2 細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的作用；馮旰珠等［45］以利巴韋林為陽性對(duì)照藥，考察熱毒寧對(duì)RSV 攻擊后Hep-2 細(xì)胞的CPE 的影響，并采用MTT 法測(cè)定各組細(xì)胞病毒抑制率，結(jié)果顯示，熱毒寧在體外對(duì)RSV 有抑制作用，且隨著濃度增加抑制效果增強(qiáng)，推測(cè)為熱毒寧某些天然分子與RSV 糖蛋白結(jié)合并改變其結(jié)構(gòu)，使其無法完成復(fù)制；張李唯等［46］發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根提取物能夠直接作用于RSV，在感染早期抑制RSV 的RNA 表達(dá)，推測(cè)能夠抑制RSV 的穿入、脫殼與生物合成，并能通過拮抗病毒NS1 蛋白激活干擾素，增強(qiáng)機(jī)體抗病毒能力發(fā)揮間接作用。

4.2 清熱藥作用于細(xì)胞因子，抑制炎癥反應(yīng) 細(xì)胞因子是一類由免疫細(xì)胞或某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激合成、分泌的低分子量蛋白質(zhì)，白介素（IL）是一類具有多種生物學(xué)活性的炎性細(xì)胞因子，在RSV 感染后的炎性反應(yīng)起重要作用。Arnold 等［47］研究發(fā)現(xiàn)人肺Ⅱ型上皮細(xì)胞（A549）感染RSV后可分泌多種細(xì)胞因子，如IL-6、IL-8，兩者水平與病毒數(shù)量有密切聯(lián)系，IL-6 可介導(dǎo)B 細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生IgG，活化T 細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（CTL）的成熟，而IL-8可趨化中性粒細(xì)胞、促進(jìn)T 細(xì)胞游走；IL-10 由調(diào)節(jié)T 細(xì)胞（Terg）產(chǎn)生，在炎癥和免疫應(yīng)答以及反饋Terg 細(xì)胞中起重要作用，可與Terg 細(xì)胞協(xié)同抑制促炎因子釋放、緩解炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力。

細(xì)胞經(jīng)病毒感染后可產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子或趨化因子，如IL-6、IL-8、TNF-α 等，雖然這些因子的釋放最初是為了防止對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的進(jìn)一步損害，但濃度過高時(shí)可能對(duì)呼吸道細(xì)胞產(chǎn)生毒性，因此，抑制這些炎癥介質(zhì)的濃度是清熱類藥物實(shí)現(xiàn)抗炎的主要途徑。清熱藥可通過蛋白質(zhì)水平干預(yù)細(xì)胞因子，抑制其炎性反應(yīng)，起到治療RSV 所致肺炎的作用，孫寒丹等［48］發(fā)現(xiàn)，RSV 感染后Hep-2 細(xì)胞IL-6、IL-8 表達(dá)均顯著增高，而金欣口服液含藥血清能顯著下調(diào)兩者高表達(dá)，推測(cè)其為抗RSV 感染的作用機(jī)制之一。

范奕熳等［49］研究發(fā)現(xiàn)清肺口服液含藥血清干預(yù)后，RSV 感染的16HBE 細(xì)胞IL-10 蛋白表達(dá)升高，趨于正常水平，提示清肺口服液可通過提升IL-10 表達(dá)水平來發(fā)揮Terg細(xì)胞的抑炎作用；董文閣等［50］研究發(fā)現(xiàn)清肺口服液可有效調(diào)節(jié)Treg／Th17 平衡，對(duì)感染RSV 小鼠體內(nèi)IL-10 有明顯促進(jìn)作用，對(duì)IL-17 有明顯抑制作用，Treg 細(xì)胞和IL-10 綜合作用可抑制炎癥因子反應(yīng)，證明清肺口服液RSV 的有效性。

RSV 感染過程含多種細(xì)胞因子共同參與和表達(dá)，近年來發(fā)現(xiàn)IL-4、IL-13、IL-10 等細(xì)胞因子與RSV 所致支氣管痙攣、氣道變態(tài)反應(yīng)炎癥等有關(guān)［51］，在多種細(xì)胞因子如何在基因水平上表達(dá)、起作用的途徑、體內(nèi)外表達(dá)的差異等方面還需要進(jìn)一步的研究。

4.3 清熱藥激發(fā)免疫系統(tǒng)功能，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用 Toll樣受體（TLRs）是免疫系統(tǒng)抵抗RSV 的天然受體，能夠連接特異性免疫。在固有免疫過程中，機(jī)體早期通過上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和呼吸道的抗原呈遞（APC）的模式識(shí)別受體（PRP）對(duì)病毒進(jìn)行識(shí)別，識(shí)別RSV 的主要PRP 就是TLRs，如TLR2、TLR3、TLR4、TLR7［52］。TLRs 與支氣管炎、肺炎過程密切相關(guān)，且在哮喘中高表達(dá)［53］，TLR2 位于細(xì)胞表面，能識(shí)別RSV 表面蛋白，激活天然免疫；TLR3可識(shí)別RNA，在抗病毒、抑制增殖、保護(hù)機(jī)體等方面起重要作用；TLR4 可識(shí)別外界病原、藥物，激活核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB），引 起下游炎癥因子釋放［54］；TLR7識(shí)別負(fù)鏈RNA 后能介導(dǎo)天然抗病毒反應(yīng)，如合成分泌Ⅰ-IFN 等。

研究發(fā)現(xiàn)［55］TLR4 基因敲除鼠的病毒清除能力和NK細(xì)胞的反應(yīng)受損，提示在抗RSV 的感染方面有重要作用；云云等［23］通過體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 與黃芩苷共孵育檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與感染組相比，黃芩苷組RAW264.7細(xì)胞的TLR4 mRNA 及蛋白的表達(dá)明顯下降，NF-κB 活化減少，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6 水平顯著降低，提示黃芩苷可以通過抑制TLR4 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮抑制RSV 感染的作用。RSV 能誘導(dǎo)TLR3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，從而進(jìn)一步促進(jìn)IFN-β 的表達(dá)，而綠原酸能調(diào)節(jié)TLR3 信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子，從而適度下調(diào)IFN-β 的過表達(dá)，既能起有效抗病毒作用，又能避免炎癥和組織損傷［56］。

通過上述研究發(fā)現(xiàn)，RSV 感染首先刺激機(jī)體激活TLRs通路，導(dǎo)致前炎性細(xì)胞因子（IL-6、IL-8 等）過度表達(dá)，造成肺部急性炎癥損傷，進(jìn)而引起支氣管痙攣等反應(yīng)。作為連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，TLRs 在RSV 感染過程中起重要作用，通過加強(qiáng)調(diào)節(jié)TLRs 及信號(hào)通路，可以有效減輕癥狀，也為新藥開發(fā)提供了新的思路。整體過程如圖1 所示。

5 清熱藥抗RSV 篩選思路

圖1 清熱藥物活性成分主要作用機(jī)制

從以上研究方法及結(jié)論可以看出，當(dāng)前針對(duì)清熱藥抗RSV 的篩選研究仍存在著研究方法單一、研究思路方法缺少創(chuàng)新性等問題，對(duì)深層次的探討有待加強(qiáng)。近年來隨著系統(tǒng)生物學(xué)的理論和方法的快速發(fā)展，可將目光由尋找單一靶點(diǎn)開始轉(zhuǎn)向綜合網(wǎng)絡(luò)分析，科學(xué)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和組學(xué)技術(shù)尋找藥物在網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)中的作用與靶標(biāo)。

5.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù) 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是伴隨系統(tǒng)生物學(xué)、組學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)而發(fā)展起來的、融合多方向前沿學(xué)科的新技術(shù)［57］，它能從整體角度探索清熱藥物與RSV 和機(jī)體之間的關(guān)聯(lián)性從而指導(dǎo)新藥的開發(fā)應(yīng)用，與傳統(tǒng)中醫(yī)的辨證論治思想和整體觀念相一致。

將目標(biāo)清熱藥物化學(xué)成分、靶點(diǎn)、對(duì)應(yīng)小兒肺炎的數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，進(jìn)而構(gòu)建基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的“清熱藥成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，系統(tǒng)解釋中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路中相互作用關(guān)系，對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行更深入的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，運(yùn)用合理的評(píng)估手段，驗(yàn)證其有效性。

5.2 代謝組學(xué)技術(shù) 代謝組學(xué)是從微觀角度出發(fā)并關(guān)注生物體內(nèi)分子量小于1 000 的內(nèi)源性代謝物，并闡述藥物作用靶點(diǎn)及機(jī)制的研究方法，是系統(tǒng)生物學(xué)的分支之一［58］。代謝組學(xué)對(duì)生物體在特定時(shí)期內(nèi)所有低分子量的代謝產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行定性和定量的分析，體現(xiàn)生物系統(tǒng)的“整體效應(yīng)”，與中醫(yī)藥思想和理論相合。

Du 等［59］采用基于UPLC／LTQ-Orbitrap-MS 的代謝組學(xué)方法，研究復(fù)方抗RSV 機(jī)制，PCA 和OPLS-DA 聯(lián)合應(yīng)用顯示，血漿中11 種生物標(biāo)記物和RSV 誘導(dǎo)的肺組織中16 種生物標(biāo)記物在治療后出現(xiàn)偏差，多個(gè)生物標(biāo)記物與脂質(zhì)代謝有關(guān)；金欣口服液治療組能夠?qū)SV 感染小鼠血漿和肺組織中此類生物標(biāo)記物的異常水平恢復(fù)。

5.3 多組學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合 越來越多的研究已將系統(tǒng)生物學(xué)研究手段成功運(yùn)用到中藥復(fù)方研究中，在一定程度上將“中藥藥效的復(fù)雜問題”可視化、直觀化。針對(duì)中藥多成分體系，可從整體研究思路出發(fā)，將多組學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合；高通量的組學(xué)信息可以構(gòu)建清熱藥復(fù)方化學(xué)成分與生物系統(tǒng)相互作用網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠從分子水平系統(tǒng)全面揭示復(fù)方整體療效。金欣口服液的抗炎通路［60］是通過阻斷NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）／凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白包含caspase 募集結(jié)構(gòu)域（ASC）／caspase-1 信號(hào)通路的mRNA 和相關(guān)蛋白，抑制RSV 感染小鼠的免疫炎癥反應(yīng)。

其篩選與驗(yàn)證思路如圖2 所示。

6 結(jié)論

RSV 具有高發(fā)率、高危害性，引發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病常年在嬰幼兒、老年人及免疫缺陷病人中大范圍流行。西醫(yī)治療局限于藥物對(duì)病原單靶點(diǎn)作用，藥物和疫苗的研發(fā)都具有滯后性［61］，藥物治療方面常用利巴韋林和帕利珠，均因療效、成本、安全性等問題，已不推薦用于患兒治療［62］；預(yù)防治療尚無成熟的抗RSV 疫苗上市，F(xiàn) 蛋白抑制劑Presatovir（GS-5806）尚處于二期臨床研究階段［63］。傳統(tǒng)中藥治療感染性疾病歷史悠久，在安全性和有效性方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，越來越引起人們的廣泛關(guān)注。

清熱藥為臨床常用的抗病毒藥物，具有明確的理論依據(jù)和臨床療效，現(xiàn)代藥理研究也顯示清熱類中藥可通過多途徑抗RSV，這些成果進(jìn)一步為清熱藥的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)，也為抗病毒新藥的研發(fā)提供了一定的參考。本研究回顧了近年來清熱類藥物抗RSV 的相關(guān)研究，提出了以系統(tǒng)生物學(xué)為參考的發(fā)現(xiàn)新藥的思路方法。在藥理研究方面，清熱藥的作用機(jī)制以直接作用于病毒、作用于細(xì)胞因子、提高免疫為主，但目前尚未全面細(xì)致地揭示其抗病毒機(jī)制，仍需要大量高層次的研究，以進(jìn)一步探明有效成分群和作用靶點(diǎn)群。