周辰杰，黨 平，周翠霞，張曉晨

（1.蘇州紅冠莊國藥股份有限公司，江蘇 昆山 215343；2.上海中醫(yī)藥大學中藥學院，上海 201203）

鹿血為鹿科動物的血液，鹿種的基源產(chǎn)自我國東北地區(qū)，據(jù)《本草綱目》記載：“鹿血主陽痿、補虛、止腰痛、鼻衄、跌傷、狂犬傷，和酒服治肺痿吐血，及崩中帶下，諸氣痛欲危者飲之立愈。大補虛損，益精血，解痘毒、藥毒”。鹿血來源于《中國藥典》鹿茸基源梅花鹿Cervus nipponTemminck 或馬鹿Cervus elaphusLinnacus 的新鮮血液，作為珍貴的中藥材在藥用或功能性食品方面被廣泛認可，如鹿血酒、鹿血晶等制品。鹿血飲片含有多種活性成分，并且在人類血液系統(tǒng)疾病和惡性腫瘤的治療中取得良好效果［1-4］，其中也包含臨床研究報道［5-6］。因鹿血產(chǎn)品較昂貴，也成為了不法分子造假或者以次充好的對象，近年來有了一些對鹿血真?zhèn)魏推焚|(zhì)檢測的文獻報道，但結(jié)果仍存在一定偏差［7］。為了確保鹿血的真實度和純度，從源頭上控制鹿血的品質(zhì)，課題組在相關(guān)鹿血鑒別文獻［8-9］的基礎(chǔ)上采用聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)（PCR）成功鑒別了包括基源藥材梅花鹿血在內(nèi)的10 種常見物種（鹿、豬、馬、驢、牛、羊、兔、雞、鴨、鵝）血液樣本線粒體DNA 序列上的差異，并且方法簡便快速［10-11］，以期為制定鹿血飲片的炮制規(guī)范提供依據(jù)。

聚合酶鏈式反應(yīng)是一種用于放大擴增特定DNA 片段的分子生物學技術(shù)，是生物體外的特殊DNA 復制，其最大優(yōu)勢便是將微量樣品中的DNA 片段大幅增加，從而達到放大核酸信號的目的。PCR 具有極高的反應(yīng)靈敏性和特異性，能夠區(qū)分少至幾個核苷酸堿基的差異，無論是化石中的古生物、或是幾十年前兇殺案遺留的殘骸，只要分離出微量的DNA，就能以PCR 技術(shù)放大，進行比對。由于進化過程中不同物種的遺傳物質(zhì)DNA 存在序列上的保守和多變性，因此物種之間存在一定的差別，其中線粒體DNA 相對基因組DNA 具有更高的突變率和遺傳多變性，因此線粒體DNA序列上的差別及其特異性便更多地運用于不同物種、相近物種及物種內(nèi)部的進化分析和診斷檢驗［12-14］。

本課題組采用PCR 技術(shù)不但鑒定了鹿血和其他常見家畜家禽血液線粒體DNA 序列的不同，同時也以此技術(shù)鑒別了4 個鹿科物種（東北梅花鹿、東北馬鹿、塔河馬鹿、坡鹿、白唇鹿，其中東北馬鹿、塔河馬鹿為馬鹿的2 個亞種，共5 種鹿科動物血液）在該序列上的差異，也為來源于不同鹿科物種的血液鑒別提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 鹿血晶制備 取鹿科動物梅花鹿Cervus nipponTemminck 或馬鹿Cervus elaphusLinnacus 的新鮮血液，勻漿，過濾，濾液噴霧，凍結(jié)，依法循環(huán)操作，使凍結(jié)物至一定厚度，冷凍干燥，干燥品表面呈紫紅色或紫黑色、具晶體光澤、大小不一的碎片。樣本由蘇州紅冠莊國藥股份有限公司提供。

1.2 動物樣本 東北梅花鹿（Cervus nipponTemminck）、東北馬鹿（Cervus elaphusXanthopygus）樣本為鮮血，血液樣本中均添加抗凝劑，于-20 ℃保存；塔河馬鹿（Cervus elaphusYarkandensis）、坡鹿（Cervus eldii）樣本為血干粉，白唇鹿（Cervus albirostris）樣本為毛發(fā)（此樣本來源見討論部分）；鹿血晶DNA 模板取樣于鹿血晶中藥飲片；所有動物血液樣本均采自蘇州紅冠莊國藥股份有限公司長春分公司，國家重點保護野生動物馴養(yǎng)繁殖許可證號林護馴繁（吉）2014-55。

1.3 引物 供本實驗鑒定用的引物體系以對比各物種線粒體DNA（mtDNA）上的D-loop 區(qū)序列進行設(shè)計，由上海生工生物工程股份有限公司合成。序列見表1。

1.4 試劑 DNA 抽提試劑盒（德國Qiagen 公司）；預(yù)混Taq 酶（天津市萊博科技有限公司）；瓊脂糖（德國Sigma公司）；磷酸緩沖液；溴化乙錠；50 bp DNA 分子標記［天根生化科技（北京）有限公司］；電泳緩沖液。

表1 鑒定用引物體系的特異性引物序列

1.5 儀器 Sigma 1-14 臺式離心機（德國Sigma 公司）；Bio-Rad T-100PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；HE-120 水平電泳儀、UV-2000 凝膠紫外分析割膠儀（上海天能科技有限公司）。

1.6 試劑制備 溴化乙錠貯備液10 mg／mL；磷酸緩沖液（NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO41.42 g、KH2PO40.27 g，加水至1 L，調(diào)pH 7.4）；電泳緩沖液（Tris 121 g、EDTA 11.5 g、冰醋酸28.55 mL，加水至500 mL）。

1.7 鹿鮮血樣本DNA 模板提取［8，13-14］按文獻［5］的鮮血樣本提取方法，使用“DNeasy? Blood ＆ Tissue Kit”試劑盒，或“TIANamp Genomic DNA Kit”試劑盒，以柱親和層析法提取DNA。取動物血液樣本200 μL，置于1.5 mL離心管中，依次加入蛋白酶K、AL 裂解緩沖液，分別吹打混勻；56 ℃水浴保溫10 min；加入無水乙醇，吹打混勻，進樣至DNA 純化柱中，8 000 r／min 離心1 min；棄過濾液，分別加入AW1、AW2 漂洗液，8 000、14 000 r／min 離心1、3 min；棄去過濾液，再離心1 min，將DNA 純化柱移入新1.5 mL 離心管中，加入洗脫緩沖液，室溫放置1 min 后，8 000 r／min離心1 min，取洗脫下的DNA 溶液，作為供試品溶液，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 鹿血晶樣本DNA 模板提取［10，15］使用DNeasy?Blood ＆ Tissue Kit 或TIANamp Genomic DNA Kit 試劑盒，以柱親和層析法提取DNA。取鹿血晶20 mg，置1.5 mL 離心管中，加入磷酸鹽緩沖液振蕩溶解，加入蛋白酶K、AL 裂解緩沖液吹打混勻，56 ℃水浴保溫10 min，之后按“1.7”項下方法提取。

1.9 鹿毛發(fā)樣本DNA 模板提取 使用DNeasy? Blood ＆Tissue Kit 試劑盒，以柱親和層析法提取DNA。取鹿毛發(fā)20 mg，剪碎，置1.5 mL 離心管中，用75%乙醇清洗2 次，再用雙蒸水清洗3 次，加入ATL 緩沖液、蛋白酶K 吹打混勻，于56 ℃ 水浴消化過夜，之后按“1.7”項下方法提取。

1.10 PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 在200 μL 薄壁管中進行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系的總體積為10 μL，包括預(yù)混Taq 酶5 μL、鑒別引物正反向各1 μL、DNA 模板1 μL、雙蒸水2 μL。將離心管置PCR 儀，PCR 反應(yīng)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)35 次（94 ℃，45 s；56 ℃，45 s；72 ℃，45 s），延伸（72 ℃）10 min。

1.11 電泳檢測 采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR 產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠濃度為1.5%，凝膠中加入核酸染色劑溴化乙錠；PCR 反應(yīng)液的上樣量為8 μL，DNA 分子量標記上樣量為5 μL（0.08 μg／μL）。在120 V 下電泳約30 min。完成電泳后，在紫外透射儀或凝膠成像儀上對凝膠片進行檢測。

1.12 PCR 檢測 將5 種鹿科物種的DNA 模板按相同比例混合，即各組分的占比為20%，作為PCR 反應(yīng)的模板。在200 μL 薄壁管中進行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系的總體積為10 μL，包括預(yù)混Taq 酶5 μL、鑒別引物正反向各1 μL、混合模板1 μL、雙蒸水2 μL。將離心管置于PCR 檢測儀，PCR 反應(yīng)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)40 次（94 ℃，45 s；56 ℃，45 s；72 ℃，45 s），延伸（72 ℃）10 min。

1.13 測序與BLAST

制備測序樣品的PCR 反應(yīng)總體積為20 μL，反應(yīng)體系包括Taq 酶10 μL、鑒別引物正反向各2 μL、DNA 模板2 μL、無菌雙蒸水4 μL。將離心管置PCR 儀上，反應(yīng)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)40 次（94 ℃，45 s；56 ℃，45 s；72 ℃，45 s），延伸（72 ℃）10 min。

PCR 反應(yīng)結(jié)束后，從每一管預(yù)測序樣品中吸取5 μL 電泳檢測，沒有問題便提交測序公司測序。同時，需提交測序樣品所使用的正反向引物各10 μL，濃度5 μmol／L。

將正反向測序結(jié)果拼接，作為最終測序結(jié)果，使用BLAST 工具對測序結(jié)果進行數(shù)據(jù)庫比對。

2 結(jié)果

2.1 PCR 結(jié)果 見圖1～2。

2.2 方法學考察

2.2.1 重復性考察 將同批次的供試品以相同的PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件重復進行6 次上述PCR 實驗。結(jié)果見圖3～8。

東北梅花鹿的特異性引物僅對東北梅花鹿DNA 模板特異性擴增出247 bp 大小的條帶，而其他物種DNA 模板無擴增，6 次實驗結(jié)果一致。

東北馬鹿的特異性引物僅對東北馬鹿DNA 模板特異性擴增出164 bp 大小的條帶，而其他物種DNA 模板無擴增，6 次實驗結(jié)果一致。

圖1 各樣品DNA 模板特異性擴增條帶

圖2 5 種鹿的特異性引物PCR 擴增DNA 條帶

塔河馬鹿的特異性引物僅對塔河馬鹿DNA 模板特異性擴增出299 bp 大小的條帶，而其他物種DNA 模板無擴增，6 次實驗結(jié)果一致。

坡鹿的特異性引物僅對坡鹿DNA 模板特異擴增出401 bp大小的條帶，而其他物種DNA 模板無擴增，6 次實驗結(jié)果一致。

白唇鹿的特異性引物僅對白唇鹿DNA 模板特異性擴增出534 bp 大小的條帶，而其他物種DNA 模板無擴增，6 次實驗結(jié)果一致。

各種鹿科物種的特異性引物都能從混合模板中擴增出相對應(yīng)的鹿科物種特異性大小條帶，6 次實驗結(jié)果一致。

綜上所述，東北梅花鹿、東北馬鹿、塔河馬鹿、坡鹿、白唇鹿鑒定用引物體系都表現(xiàn)了很好的一致性，所有陽性、陰性結(jié)果都能夠重復。

2.2.2 重復性試驗 通過3 家實驗室以相同的方法、條件進行試驗，來考察東北梅花鹿、東北馬鹿、塔河馬鹿、坡鹿、白唇鹿鑒定用引物體系的重復性。

2.2.3 中間精密度試驗 同一實驗室的不同人員，在不同時間進行試驗，對東北梅花鹿、東北馬鹿、塔河馬鹿、坡鹿、白唇鹿鑒定用引物體系進行中間精密度考察，上述重復性試驗便是由不同的人員在不同的時間內(nèi)完成。結(jié)果顯示，均能再現(xiàn)一致的試驗結(jié)果，驗證了梅花鹿、東北馬鹿、塔河馬鹿、坡鹿、白唇鹿鑒定用引物體系的中間精密度。

3 討論

由于前期的鹿和其他9 種家畜家禽鑒定用引物體系中的鹿引物無法對于不同鹿種進行鑒別［7］，于是課題組建立了這套針對不同鹿種的引物體系，用來鑒別正品鹿血、正品鹿血藥材和飲片的具體來源。

圖2 顯示，使用東北梅花鹿、東北馬鹿、塔河馬鹿、坡鹿、白唇鹿鑒定用引物體系來對鹿血晶DNA 模板擴增，其中東北梅花鹿、東北馬鹿、塔河馬鹿的引物都能夠從鹿血晶DNA 模板中擴增出條帶，而坡鹿和白唇鹿的引物無此條帶，表明鹿血晶的原料來源為梅花鹿和馬鹿的血液，其中并不含坡鹿和白唇鹿這兩種國家保護動物的血液。

白唇鹿屬于我國一級保護動物，僅分布于青藏高原，樣本采集困難，課題組從位于四川西部的新路海白唇鹿自然保護區(qū)中采集到了毛發(fā)樣本，從中提取DNA 來進行研究。

圖3 東北梅花鹿特異性引物PCR 擴增DNA 條帶

圖4 東北馬鹿特異性引物PCR 擴增DNA 條帶

圖5 塔河馬鹿特異性引物PCR 擴增DNA 條帶

圖6 坡鹿特異性引物PCR 擴增DNA 條帶

圖7 白唇鹿特異性引物PCR 擴增DNA 條帶

圖8 5 種鹿科物種特異性引物PCR 擴增DNA 條帶

由于該物種數(shù)量不多，因此在GenBank 數(shù)據(jù)庫中的序列數(shù)據(jù)相比其他鹿種要少很多。在設(shè)計引物時課題組發(fā)現(xiàn)，即使在GenBank 有限的白唇鹿序列中，也出現(xiàn)了2 套不一樣的數(shù)據(jù)，其中之一為四川大學所提交的HM049636.1 等，另一套為法國和吉林的研究者提交的JN632690.1 與GQ304765.1 等，這2 套不同的序列經(jīng)過對比表現(xiàn)出了很大的不一致性，其區(qū)別已經(jīng)和其他同屬不同種的鹿物種之間的序列差別相當。課題組無法設(shè)計一套引物來涵蓋這2 種白唇鹿并將其與其他鹿種區(qū)分開來，于是根據(jù)這2 套數(shù)據(jù)分別設(shè)計了引物。

通過PCR 實驗以及測序驗證，課題組從新路海所采集的白唇鹿標本能夠匹配上述后一套數(shù)據(jù)，既法國和吉林的研究者所提交的數(shù)據(jù)；自然PCR 產(chǎn)物的測序結(jié)果與四川大學所提交的序列有較大不同，因此根據(jù)這套序列所設(shè)計的引物是無法從所采集的白唇鹿標本中擴增出條帶的。課題組所提交的引物體系中的白唇鹿引物是經(jīng)過驗證，能夠從所采集到的白唇鹿樣本中擴增出條帶的引物。

從目前所掌握的情況看，白唇鹿物種應(yīng)該沒有分亞種，因此其個體間的序列差別不應(yīng)該像上述2 套序列數(shù)據(jù)之間的差別那么顯著。至于為什么會出現(xiàn)這種情況，并不在課題組這系列實驗的研究范圍內(nèi)，課題組也沒有資源在短時間內(nèi)完全解決這個疑問。

本研究建立了針對不同鹿科物種的鑒定引物體系，能夠鑒別東北梅花鹿、東北馬鹿、塔河馬鹿、坡鹿、白唇鹿，通過PCR 實驗、測序、方法學驗證，證明了該體系的有效性和可靠性。