李 斐，董嘉皓，魏飛亭，喬日發(fā)，陳海芳，楊武亮，楊 明，袁金斌

（江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004）

中藥的入藥形式多種多樣，有的以粉末直接入藥，如散劑、丸劑；有的以提取物的形式入藥［1-3］。入藥形式不同，所含化學(xué)成分會(huì)有差異，藥物功效也存在區(qū)別，不同入藥形式對(duì)中藥藥效或毒性的影響可通過(guò)化學(xué)成分含有量的變化來(lái)分析。

吳茱萸為吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang 或疏毛吳茱萸Euodia ru-taecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang的干燥近成熟果實(shí)，性熱，味辛、苦；有小毒［4］。臨床上，吳茱萸的入藥形式主要有2 種，為粉末入藥，如戊己丸；為水煎劑，如復(fù)方吳茱萸湯、左金方。中醫(yī)的遣方用藥有其科學(xué)內(nèi)涵，揭示吳茱萸在不同方藥中的用藥特點(diǎn)，弄清楚不同入藥形式中化學(xué)組分含有量的差異是其基礎(chǔ)和前提。

吳茱萸主要含生物堿、黃酮、檸檬苦素、酚酸、揮發(fā)油等［4-6］，已有的研究主要集中在生物堿和檸檬苦素類(lèi)［4-5，7-8］，較少涉及黃酮、酚酸類(lèi)［9-11］。根據(jù)文獻(xiàn)［9-11］和前期研究［12-14］，課題組選取了9個(gè)代表性化合物作為含有量測(cè)定指標(biāo)，分析吳茱萸不同入藥形式中化學(xué)成分的差異。本研究充分優(yōu)化了UPLC 條件，建立了吳茱萸2 種提取物中多成分含有量的同時(shí)測(cè)定方法，以期為該藥材用藥特點(diǎn)、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量評(píng)價(jià)研究提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）；AE240 電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；PS-80 A 超聲波清洗機(jī)（東莞市潔康超聲波設(shè)備有限公司）；L-500 型離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；116B 型高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）。

新綠原酸（批號(hào)CFN97472）、隱綠原酸（批號(hào)CFN99117）對(duì)照品購(gòu)自武漢天然植物生物技術(shù)有限公司；綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110753-200413、110802-200504、0801-9702；蘆丁、金絲桃苷對(duì)照品購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)分別為16122011、16 102605；去氫吳茱萸堿（批號(hào)P24M7F11741）對(duì)照品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；吳茱萸新堿（批號(hào)15266-38-3）對(duì)照品購(gòu)自上海胤珂生物科技有限公司，以上對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%。乙腈和甲醇（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；其他試劑均為分析純。

藥材均為課題組實(shí)地采集，信息見(jiàn)表1，標(biāo)本保存于江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸新堿對(duì)照品適量，置于10 mL 量瓶中，無(wú)水甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得單一成分貯備液。分別精密吸取上述9 個(gè)貯備液1 mL 加入10 mL 量瓶中，無(wú)水甲醇定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為0.228、0.506、0.198、0.021、0.126、0.252、0.501、0.252、0.511 mg／mL 的對(duì)照品溶液。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2.1.2 供試品溶液

2.1.2.1 吳茱萸醇提液［12］藥材放入60 ℃烘箱中烘2 h，粉碎，取粉末約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入70%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，浸泡1 h 后超聲40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，70%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.2.2 吳茱萸水煎液 取上述藥材粉末約0.3 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入雙蒸水25 mL，稱定質(zhì)量，浸泡1 h 后加熱回流40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，雙蒸水補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.2 色譜條件 Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相0.1%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，4%～5% B；3～9 min，5%～6% B；9～12 min，6%～8%B；12～15 min，8%～20%B；15～20 min，20%～35% B；20～27 min，35%～80% B；27～35 min，80%～100%B；35～40 min，100%B）；體積流量0.3 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)326 nm；進(jìn)樣量1 μL。在該色譜條件下，各目標(biāo)化合物獲得了較好的分離，見(jiàn)圖1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 依次稀釋上述對(duì)照品溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，以信噪比（S／N）分別為10 和3 時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限和檢測(cè)限。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 分別吸取水煎液、醇提液，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得水煎液中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、去氫吳茱萸堿峰面積 RSD 分別為1.2%、0.4%、0.8%、1.8%、0.9%、0.5%，醇提液中分別為0.9%、0.6%、0.7%、0.9%、0.6%、0.7%、0.6%、0.5%、0.8%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關(guān)系、檢出限、定量限Tab.2 Linear relationships，detection limits and quantitative limits of various constituents

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取藥材粉末，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備2 種供試品溶液，室溫下靜置0、2、4、6、12、24 h 后在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得煎液中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、去氫吳茱萸堿峰面積RSD 分別為1.8%、0.5%、2.4%、1.7%、0.9%、0.5%，醇提液中分別為1.7%、1.5%、1.9%、1.4%、1.0%、1.1%、0.8%、1.0%、1.1%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材12 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備2 種供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得水煎液中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、去氫吳茱萸堿峰面積RSD 分別為2.4%、0.6%、2.2%、1.6%、2.0%、0.4%，醇提液中分別為2.2%、1.7%、2.3%、2.1%、1.3%、1.0%、1.1%、1.6%、1.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱取含有量已知的藥材12 份，分成2 組，分別精密加入相當(dāng)于樣品指標(biāo)成分量100% 的9 種成分對(duì)照品貯備液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計(jì)算回收率。結(jié)果，水煎液中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、去氫吳茱萸堿平均加樣回收率分別為100.4%、98.8%、100.3%、99.9%、100.6%、99.2%，RSD 分別為1.2%、1.1%、1.4%、0.6%、1.6%、2.0%；醇提液中平均加樣回收率為99.7%、102%、101.2%、99.3%、101.2%、98.4%、98.7%、100.9%、101.1%，RSD 分別為2.9%、2.7%、2.7%、1.4%、2.7%、2.4%、2.0%、2.5%、2.1%。

2.4 不同入藥形式的影響

2.4.1 入藥形式選擇 吳茱萸的傳統(tǒng)用藥方式為水煎液和粉末，前者一直作為中藥的傳統(tǒng)入藥形式，可提取到相對(duì)有效的化學(xué)成分，有一定的合理性。吳茱萸70%乙醇提取液保留了其絕大多數(shù)化學(xué)成分，2015 年版《中國(guó)藥典》也以其為提取溶劑，故粉末可用70%乙醇提取液代替。

2.4.2 成分組成 課題組挑選了10 批藥材，涵蓋了三大品種、主要產(chǎn)區(qū)、不同年份。圖1 表明，醇提物中的成分較多，包括酚酸、黃酮、檸檬苦素、吲哚類(lèi)生物堿和喹諾酮類(lèi)生物堿；水煎液中的成分則集中在色譜圖的前半部分，大多為水溶性成分（如酚酸、黃酮、吲哚類(lèi)生物堿），幾乎不含極性較弱的喹諾酮類(lèi)生物堿。

2.4.3 含有量測(cè)定 由表3 可知，綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸含有量以樟樹(shù)豐溪產(chǎn)最高，去氫吳茱萸堿含有量以貴州凱里產(chǎn)最高，吳茱萸堿、吳茱萸次堿含有量以湖南黔陽(yáng)產(chǎn)最高，吳茱萸新堿含有量以江西新干產(chǎn)最高。

另外，醇提液（對(duì)應(yīng)于粉末入藥形式）中各化合物含有量都不低，表明70%乙醇對(duì)吳茱萸各組分有較高的提取效率；水煎液中含有量顯著低于醇提物中，以吳茱萸新堿為代表的喹諾酮類(lèi)生物堿均未檢測(cè)到。值得注意的是，水煎液中隱綠原酸含有量顯著高于醇提物中（超出平均值1.6 倍），2號(hào)色譜峰（綠原酸）前的1 個(gè)色譜峰平均峰面積之比（水煎液／醇提液）也是1.6，見(jiàn)圖1。

表3 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（%， n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（%， n=3）

3 討論與結(jié)論

王智民［5］曾指出生物堿在水煎劑中的轉(zhuǎn)移率很低，而其水溶性比較大的成分（如去氫吳茱萸堿、黃酮、綠原酸等）則相對(duì)較高，這些成分與吳茱萸的藥理活性是否有關(guān)還有待深入研究。由于綠原酸不穩(wěn)定，通過(guò)同時(shí)測(cè)定其3 種同分異構(gòu)體含有量更能準(zhǔn)確可靠地評(píng)價(jià)酚酸類(lèi)成分在醇提液和水煎液中的差異，因此本研究系統(tǒng)報(bào)道了吳茱萸中綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸含有量的同時(shí)測(cè)定。為比較吳茱萸2 種入藥形式對(duì)其組分的影響，本實(shí)驗(yàn)選取了9 個(gè)代表性化合物，可較好地反映其整體變化。

吳茱萸在臨床應(yīng)用上主要用于鎮(zhèn)痛、止嘔，文獻(xiàn)表明其醇提液的鎮(zhèn)痛效果更好［8，15］，藥效可能與部分生物堿類(lèi)成分相關(guān)；水煎液的止嘔作用更明顯，活性物質(zhì)大多為水溶性成分［13］。血清藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，除酚酸類(lèi)及黃酮類(lèi)外，生物堿類(lèi)的代謝產(chǎn)物也較多，表明吳茱萸藥理作用可能是多個(gè)成分共同作用的結(jié)果［16］。由于粉末中成分類(lèi)型較全，含有量較高，故從藥效（特別是鎮(zhèn)痛作用）方面而言，它可能是一種較好的入藥形式。

歷代本草均記載吳茱萸有小毒，現(xiàn)代研究表明其毒性程度依次為揮發(fā)油＞醇提物＞水提物［14，17-19］。吳茱萸的肝毒性可能與極性較弱的生物堿，尤其是喹諾酮類(lèi)生物堿有關(guān)［14，19］，而它在水煎液中的轉(zhuǎn)移率極低，因此從用藥的安全性來(lái)說(shuō)，水煎劑是一種比較合適的用藥形式。

中醫(yī)的遣方用藥有其科學(xué)內(nèi)涵，綜合考慮了藥物功效、毒性、安全，反映了對(duì)藥物活性組分的取舍。于吳茱萸而言，有時(shí)候主要利用其鎮(zhèn)痛功效，有時(shí)候側(cè)重其止嘔效果，有時(shí)候需長(zhǎng)期用藥而必須考慮其安全性，這時(shí)候用藥形式也應(yīng)加以考慮，如鎮(zhèn)痛施丸劑（粉末），止嘔用湯劑（水煎）。