左瑞庭，王西彬

［河南省中醫(yī)院（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院），河南 鄭州450002］

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種慢性、多關(guān)節(jié)性、系統(tǒng)性的自身免疫病，病理改變主要包括滑膜炎癥，關(guān)節(jié)軟骨和軟骨的破壞等，其中以滑膜炎癥為最主要的病理表現(xiàn)［1-2］。成纖維樣滑膜細(xì)胞是構(gòu)成滑膜組織的主要部分，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜病變中表現(xiàn)為異?；罨鲋常?-4］，成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖和凋亡的失衡與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的形成關(guān)系密切［3］。因此，抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞（RA-FLSs）增殖并促進(jìn)其凋亡對防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有重要意義。

胡桃醌是胡桃楸和核桃中存在的重要活性物質(zhì)，具有明確的抗腫瘤作用，此外，還具有抗菌、抗炎、殺蟲等藥理作用［5-7］。胡桃醌具有顯著調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的作用，如抑制成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)皮膚細(xì)胞增殖等［8-9］，可促進(jìn)宮頸癌、前列腺癌、乳腺癌和黑色素瘤等細(xì)胞的凋亡［10-12］。然而，目前為止還沒有胡桃醌與RA-FLSs的增殖和凋亡之間關(guān)系的相關(guān)報道，故本實驗對此進(jìn)行研究。

1 材料

RA-FLSs 細(xì)胞株購自歐洲動物庫。DMEM 高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國HyClone 公司；Akt 兔單克隆抗體、p-Akt 兔單克隆抗體（phospho S473）、p21 兔單克隆抗體、GAPDH 兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自英國Abcam 公司；BCA 試劑盒購自美國Pierce 公司；硝酸素纖維膜購自美國Promega 公司；MTT 購自上海生工公司；Annexin-V FITC／PI 試劑盒購自美國PharMingen 公司；BrdU 試劑盒購自美國Sigma 公司；SC79 購自碧云天公司。

2 方法

2.1 RA-FLSs 培養(yǎng) RA-FLSs 由含有10% 胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基于5%CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%即可傳代。

2.2 Annexin-V FITC／PI 檢測細(xì)胞凋亡 利用Annexin-V FITC／PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡，并按照試劑盒說明書進(jìn)行。首先用磷酸鹽緩沖溶液預(yù)冷細(xì)胞，然后用Annexin-V FITC（13 μL）于4 ℃孵育細(xì)胞28 min，PBS 洗細(xì)胞1 次，加入10 μL PI 孵育7 min，最后用流式細(xì)胞分析儀檢測細(xì)胞凋亡情況。實驗重復(fù)3 次。

2.3 caspase-3 活性檢測 收集細(xì)胞，按照試劑盒（BD ApoAlert Caspase-3 Fluorescent Assay Kit）說明書檢測caspase-3 活性，記錄結(jié)果。實驗重復(fù)3 次。

2.4 MTT 法檢測細(xì)胞活力 將RA-FLSs（5×104／孔）接種于96 孔板，不同濃度胡桃醌或Akt 激動劑處理，于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h 后，進(jìn)行MTT 實驗檢測。首先，每孔加入20 μL MTT（5 mg／mL）繼續(xù)培養(yǎng)5 h，去掉上清后每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），室溫振蕩溶解結(jié)晶甲瓚15 min，酶標(biāo)儀測定溶液在490 nm 波長處的吸光度，結(jié)果為3 次重復(fù)試驗的平均值。

2.5 BrdU 檢測 利用BrdU 試劑盒檢測細(xì)胞增殖，按照說明書進(jìn)行操作。將RA-FLSs（5×104／孔）接種于96 孔板，不同濃度胡桃醌或Akt 激動劑處理后（對照組無胡桃醌和Akt 激動劑處理），于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL BrdU 后孵育1 h，輕輕去掉上清液，每孔加入變性溶液100 μL，孵育20 min 后，按照說明書相繼加入BrdU 抗體和二抗，最后加入四甲基聯(lián)苯胺（TMB）孵育25 min，酶標(biāo)儀檢測370 nm 波長處的吸光度以反映細(xì)胞增殖的變化。每組樣品3 個復(fù)孔，每次實驗重復(fù)3 次。

2.6 Western blot 檢測 收集細(xì)胞，提取蛋白，利用BCA 試劑盒定量蛋白，將25 μg 蛋白于聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離，半干法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉膜2 h，一抗［Akt兔多抗（1∶ 500）、p-Akt 兔單抗（1∶ 500，phospho S473）、p21 兔單抗（1∶800）、GAPDH兔單抗（1∶1 000）］4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育1.5 h，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，GAPDH 為內(nèi)參對照蛋白。實驗結(jié)果為3 次重復(fù)的平均值。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0 軟件進(jìn)行處理，計量資料以（±s）表示。2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 胡桃醌對RA-FLSs 增殖的作用 與0 μmol／L胡桃醌比較，胡桃醌濃度為（30、40、50 μmol／L）時顯著抑制RA-FLSs 的細(xì)胞活力和增殖能力（P＜0.01）。見圖1。

3.2 胡桃醌對RA-FLSs 凋亡的作用 與0 μmol／L胡桃醌比較，胡桃醌濃度為（30、40、50 μmol／L）顯著促進(jìn)RA-FLSs 凋亡，并顯著促進(jìn)caspase-3 活性（P＜0.01）。見圖2。

3.3 胡桃醌對Akt 活化和p21 蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 與0 μmol／L 胡桃醌比較，30 μmol／L 胡桃醌能顯著抑制p-Akt 蛋白表達(dá)，促進(jìn)p21 蛋白表達(dá)（P＜0.01）。見圖3。

圖1 胡桃醌對RA-FLSs 增殖的影響Fig.1 Effects of juglone on the proliferation of RA-FLSs

圖2 胡桃醌對RA-FLSs 凋亡的影響Fig.2 Effects of juglone on the apoptosis of RA-FLSs

圖3 胡桃醌對Akt 活化和p21 表達(dá)的影響Fig.3 Effects of juglone on the Akt activation and p21 expression

3.4 胡桃醌通過調(diào)節(jié)Akt 磷酸化來調(diào)控p21 蛋白表達(dá) 與胡桃醌（30 μmol／L）比較，胡桃醌（30 μmol／L）和SC79（1.0、1.5、1.8 μg／mL）共同處理能顯著促進(jìn)Akt 磷酸化（P＜0.01），胡桃醌（30 μmol／L）和SC79（1.0 μg／mL）共同處理后p21 蛋白表達(dá)顯著下降，顯著抑制細(xì)胞凋亡，增殖能力顯著升高（P＜0.01）。見圖4。

4 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是常見的全身性自身免疫性疾病，主要侵犯關(guān)節(jié)滑膜，嚴(yán)重者可致關(guān)節(jié)變形，心、肺、腎等臟器也可受累［13］，其分布廣，病程長，反復(fù)發(fā)作，具有發(fā)病率、致殘率高的特點［14］。成纖維樣滑膜細(xì)胞大量增生是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生的中心事件，在其病理機(jī)制中起關(guān)鍵作用［13］。胡桃醌屬于萘醌類，是胡桃科植物胡桃及黑核桃中的重要活性物質(zhì)，具有抗炎、抑菌和抗腫瘤的作用［15］，研究表明，它對細(xì)胞增殖能力具有調(diào)控作用；Wahedi 等［8］報道胡桃醌具有促進(jìn)皮膚細(xì)胞增殖的作用，促進(jìn)傷口愈合；Wang 等［16］研究發(fā)現(xiàn)胡桃醌可有效抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和遷移；Hu等［17］報道表明胡桃醌對乳腺癌細(xì)胞系MCF7Adr 的增殖和侵襲能力具有抑制作用；Zhang 等［18］證實胡桃醌可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞系SiHa 的凋亡過程。在甲狀腺低分化癌的細(xì)胞中，胡桃醌顯著促進(jìn)其凋亡［19］；同時，胡桃醌對肝細(xì)胞癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞的凋亡也具有誘導(dǎo)作用［12，20］，然而，目前為止仍沒有研究表明胡桃醌對成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖和凋亡是否有作用。本實驗利用不同濃度胡桃醌孵育RA-FLSs 24 h，結(jié)果表明胡桃醌濃度為30 μmol／L 時顯著抑制RA-FLSs 細(xì)胞的生長活力和增殖能力，同時顯著促進(jìn)RA-FLSs 細(xì)胞的凋亡，說明它可有效抑制RA-FLSs 增殖且促進(jìn)其凋亡。

圖4 胡桃醌調(diào)節(jié)RA-FLSs 增殖和凋亡的相關(guān)分子機(jī)制Fig.4 Molecular mechanisms of regulation of RA-FLSs proliferation and apoptosis by juglone

有報道表明，胡桃醌在乳腺癌細(xì)胞SKBR3 中可抑制Akt 的活化［21］；Li 等［22］發(fā)現(xiàn)抑制Akt 活性可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞中p21 的表達(dá)。Akt 又稱為蛋白激酶B（PKB），是細(xì)胞增殖和凋亡的重要調(diào)控因子［23］，激活后具有促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞、海馬神經(jīng)元和膽囊癌細(xì)胞增殖的能力［24-25］，Akt 活性被抑制后，誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞和胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞［26-27］。p21 是已知的具有最廣泛激酶抑制活性的細(xì)胞周期抑制蛋白，參與細(xì)胞的生長、分化、衰老及死亡過程［28］，Audo 等［29］發(fā)現(xiàn)p21 可誘導(dǎo)RA-FLSs 細(xì)胞的凋亡，p21 的下調(diào)推動細(xì)胞周期進(jìn)程，導(dǎo)致RAFLSs 增殖［30］，但目前仍無研究表明RA-FLSs 中胡桃醌、Akt 和p21 之間的調(diào)控關(guān)系。本實驗中胡桃醌（30 μmol／L）與不同濃度Akt 激動劑SC79 同時 孵育RA-FLSs 24 h 后顯示，SC79 濃度為1.0 μg／mL時，p21 蛋白表達(dá)較胡桃醌（30 μmol／L）孵育RA-FLSs 24 h 顯著降低，表明胡桃醌可通過調(diào)節(jié)Akt 活性來調(diào)節(jié)p21 蛋白表達(dá)；胡桃醌（30 μmol／L）與SC79（1.0 μg／mL）同 時 孵育RA-FLSs 24 h 后，細(xì)胞凋亡率降低、增殖能力升高較胡桃醌（30 μmol／L）孵育RA-FLSs 24 h 明顯，表明在RA-FLSs 中胡桃醌可通過調(diào)節(jié)p21 蛋白表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡，與文獻(xiàn)報道p21 對RAFLSs 增殖和凋亡的作用一致［29-30］。因此，胡桃醌可通過Akt 來調(diào)節(jié)p21 蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制RAFLSs 增殖和促進(jìn)其凋亡。

綜上所述，胡桃醌具有抑制RA-FLSs 細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的作用，并可通過調(diào)控Akt 磷酸化調(diào)節(jié)p21 蛋白表達(dá)。胡桃醌對p21 的調(diào)節(jié)實現(xiàn)了它對RA-FLSs 增殖和凋亡的調(diào)控作用，可為治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供更多的參考。