蔡碧蓮 文亦磊 羅偉生

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，南寧市 530023，電子郵箱：343947704@qq.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南寧市 530023)

肝纖維化的形成過(guò)程涉及多種因素、多種細(xì)胞的共同作用，以及眾多信號(hào)通路交叉與疊加。而在這復(fù)雜的病理發(fā)展過(guò)程中，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活狀態(tài)與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。既往已有許多學(xué)者對(duì)細(xì)胞因子與HSC激活態(tài)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行研究，但其作用機(jī)制尚未明確。此外，一條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能與多種細(xì)胞因子有關(guān)，一種細(xì)胞因子也可能激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，或細(xì)胞因子的信號(hào)在轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程中，又受到其他因素的調(diào)控，形成錯(cuò)綜復(fù)雜的信號(hào)傳輸網(wǎng)絡(luò)。因此HSC的激活狀態(tài)與細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)十分復(fù)雜。

荔枝廣泛種植并盛產(chǎn)于中國(guó)西南部和東南部，其果核因藥用價(jià)值高，被列為上等藥材。荔枝核屬無(wú)患子科植物，味甘、微苦，歸肝、腎經(jīng)，具有行氣散結(jié)、祛寒止痛的功效。荔枝核富含黃酮類、甾體類、鞣質(zhì)等化學(xué)成分，其中黃酮類為主要的活性成分[1]。本課題組前期已證實(shí)荔枝核總黃酮(total flavone ofLitchichinensisSonn.,TFL)具有抗肝纖維化的作用[2-4]。劉瑞等[5]的研究表明，TFL通過(guò)上調(diào)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPAR-γ)，下調(diào)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子，從而延緩肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。目前對(duì)PPAR-γ與Smad4信號(hào)通路的交叉作用知之甚少。 本實(shí)驗(yàn)旨在探討TFL對(duì)大鼠HSC-T6增殖以及PPAR-γ和Smad4表達(dá)的影響，以期為臨床治療肝纖維化新藥的開發(fā)與應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫(kù)。TFL購(gòu)自南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司(批號(hào)：ZL131022300Y)，純度為85%；PPAR-γ天然配體前列腺素J2(15-d-PGJ2)購(gòu)自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司；PPAR-γ特異性拮抗劑GW9662購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(批號(hào)：GPV1432)。胎牛血清、高糖杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)購(gòu)自加拿大維森特公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒購(gòu)自Dojindo公司(批號(hào)：NU680)；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒以及PPAR-γ、Smad4、內(nèi)參的引物購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司(批號(hào)：AI91404A、AI40713A、AI62519A)；Smad4、PPAR-γ細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Cusabio公司。 酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo公司(型號(hào)：1510)。

1.2 細(xì)胞分組 從液氮罐中取出凍存的HSC-T6細(xì)胞株，立即將其置于 37℃恒溫水浴鍋中來(lái)回晃動(dòng)，凍存管口高于水面；將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中(2×105個(gè)細(xì)胞/孔)，分為15-d-PGJ2+TFL組、GW9662+TFL組、TFL組、對(duì)照組。于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。15-d-PGJ2+TFL組加入5 μmol/L 15-d-PGJ2及100 μmol/L TFL各10 μL，GW9662+TFL組加入10 μmol/L GW9662及100 μmol/L TFL各10 μL，TFL組加入100 μmol/L TFL 10 μL，作用72 h。對(duì)照組不加入任何藥物或試劑，僅加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)HSC-T6生長(zhǎng)活力 將1.2干預(yù)后的HSC-T6細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，將新鮮的完全培養(yǎng)基及10 μL CCK-8試劑加入每個(gè)培養(yǎng)板孔內(nèi)，混勻后培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定A值，各待測(cè)樣本的A值記為測(cè)量值，空白對(duì)照的A值記為空白值，終值=測(cè)量值-空白值。

1.4 實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè) HSC-T6中PPAR-γ及Smad4 mRNA表達(dá)水平 將1.2干預(yù)后的細(xì)胞懸液加入6孔的培養(yǎng)板內(nèi)，并在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用TRIzol法提取每組細(xì)胞的總RNA,再將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。引物序列見表1。用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)基因mRNA表達(dá)水平，PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，95℃ 15 s，60℃ 1 min共40個(gè)循環(huán)，同時(shí)做融解曲線。以上實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。用2-△△Ct法計(jì)算各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.5 ELISA檢測(cè)HSC-T6中PPAR-γ、Smad4蛋白表達(dá)水平 收集加藥處理48 h后的細(xì)胞上清液，每孔加入按說(shuō)明書配制好的標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)液50 μL，再加入酶標(biāo)抗體工作液50 μL。充分混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，洗滌4～6次，濾紙上印干。每孔加入底物工作液100 μL，置37℃暗處反應(yīng)15 min，然后加入100 μL終止液混勻，30 min內(nèi)于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)A值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)活力比較 15-d-PGJ2+TFL組、GW9662+TFL組、TFL組、對(duì)照組的A450值分別為1.309±0.009、1.762±0.016、1.521±0.012、2.234±0.093，4組生長(zhǎng)活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 037.794，P<0.001)。15-d-PGJ2+TFL組、GW9662+TFL組、TFL組的A450值均低于對(duì)照組(均P<0.05)；與TFL組比較，15-d-PGJ2+TFL組A450值降低，而GW9662+TFL組A450值升高(均P<0.05)。

2.2 4組PPAR-γ、Smad4的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與對(duì)照組比較，其余3組PPAR-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，Smad4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低(均P<0.05)；與TFL組比較，15-d-PGJ2+TFL組PPAR-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量升高而Smad4 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，GW9662+TFL組PPAR-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量降低而Smad4 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高(均P<0.05)。見表2。

表2 4組PPAR-γ、Smad4mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白含量比較(x±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3 4組HSC-T6 PPAR-γ、Smad4蛋白含量比較 與對(duì)照組比較，其他3組PPAR-γ蛋白的相對(duì)表達(dá)量均升高，Smad4蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低(均P<0.05)；與TFL組比較，15-d-PGJ2+TFL組Smad4蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，GW9662+TFL組Smad4蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(均P<0.05)。見表2。

3 討 論

肝纖維化是指在生物、物理、化學(xué)等因素的作用下，肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織發(fā)生異常增生，與此同時(shí)肝細(xì)胞內(nèi)外基質(zhì)也異常沉積，這是許多慢性肝病共同的病理過(guò)程。若積極治療，肝纖維化是可逆的[6]，反之，在慢性肝病初期即肝纖維化時(shí)，未能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)并治療，則會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。介導(dǎo)肝纖維化[7]、肝硬化[8]發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)是HSC。肝臟受損后，HSC增殖并激活，轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，還可以分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分[9]，通過(guò)合成膠原酶維持正常的基底膜結(jié)構(gòu)?？傊?，在激活過(guò)程中，HSC在組織炎癥壞死區(qū)域向成肌纖維轉(zhuǎn)型。激活狀態(tài)的HSC不僅能表達(dá)多種纖維化因子、炎癥因子等，還能表達(dá)各種細(xì)胞外基質(zhì)成分。此外，HSC還能使得細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解發(fā)生紊亂，最終導(dǎo)致大量細(xì)胞外基質(zhì)積聚，從而引發(fā)肝纖維化[10]。因此，抑制HSC激活是治療肝病終期的關(guān)鍵步驟。

近年相關(guān)研究結(jié)果顯示，抗氧化、減輕炎癥、保肝護(hù)肝是TFL主要的藥理作用[11-12]。本研究結(jié)果顯示，TFL組的A450值低于對(duì)照組(P<0.05)，提示TFL能有效地抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，對(duì)延緩肝纖維化發(fā)生發(fā)展進(jìn)程有重要的作用。研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)纖維化的發(fā)生發(fā)展[13]。Smad 蛋白家族主要分為3類，即受體調(diào)節(jié)性Smad、通用性Smad及抑制性Smad[14]。迄今為止，Smad蛋白家族是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中最為重要的底物，其機(jī)制是Smad發(fā)生磷酸化后，核膜被穿透而發(fā)生化學(xué)變化。因此，Smad在細(xì)胞內(nèi)的作用是傳導(dǎo)信號(hào)。作為核轉(zhuǎn)錄因子，PPAR-γ在細(xì)胞增殖和激活狀態(tài)過(guò)程中起著舉足輕重的調(diào)節(jié)作用。換言之，抑制HSC激活狀態(tài)可延緩肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，而PPAR-γ通路在此過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此，PPAR-γ或可成為治療纖維化疾病的藥理學(xué)新靶點(diǎn)[15]。本研究中，與對(duì)照組比較，TFL組的PPAR-γ mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，Smad4 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低(均P<0.05)。由此推斷，TFL在體外對(duì)HSC-T6增殖的抑制作用可能是通過(guò)上調(diào)PPAR-γ表達(dá)、下調(diào)Smad4表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)的異常沉積，進(jìn)而阻斷肝纖維化的形成與發(fā)展進(jìn)程。

GW9662是PPAR-γ選擇性不可逆拮抗劑，其可導(dǎo)致PPAR-γ信號(hào)通路受到抑制，同時(shí)會(huì)加快肝纖維化的進(jìn)程。而給予活化的HSC多種內(nèi)源或外源性PPAR-γ配體可顯著抑制 HSC 纖維生成活性[16]。本研究中，GW9662+TFL組PPAR-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量低于TFL組，而A450值高于TFL組(均P<0.05)，但其PPAR-γ mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量仍高于對(duì)照組，且A450值仍低于對(duì)照組(P<0.05)，提示雖然GW9662可拮抗PPAR-γ而削弱TFL對(duì)HSC-T6增殖的抑制作用，但TFL仍可通過(guò)上調(diào)PPAR-γ表達(dá)而發(fā)揮一定的作用。15-d-PGJ2作為PPAR-γ的激動(dòng)劑，作用與GW9662截然不同，其能誘導(dǎo)激活PPAR-γ信號(hào)通路，有效地抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，從而延緩肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，與TFL組比較，15-d-PGJ2+TFL組A450值、Smad4 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)。這提示TFL聯(lián)合PPAR-γ的激動(dòng)劑，可進(jìn)一步上調(diào)PPAR-γ表達(dá)、下調(diào)Smad4表達(dá)，從而更好地抑制HSC-T6增殖。

綜上所述，TFL可抑制HSC 的活化，其機(jī)制與激活PPAR-γ、抑制Smad4表達(dá)有關(guān)；而TFL聯(lián)合PPAR-γ激動(dòng)劑可更好地抑制HSC-T6增殖。肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，涉及多種細(xì)胞、多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其機(jī)制極其復(fù)雜，若單純從TFL對(duì)某種細(xì)胞或某條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的角度來(lái)探討其發(fā)生機(jī)制，存在一定的局限性。因此可期待后續(xù)能從細(xì)胞信號(hào)通路交聯(lián)的角度，進(jìn)一步完善TFL對(duì)肝纖維化作用機(jī)制的研究，以期TFL能用于臨床治療肝纖維化新藥的開發(fā)與應(yīng)用。