韓俊麗 田紅燕 劉 亞 范粉靈

(1 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，陜西省西安市 710004，電子郵箱:lijunhan78@163.com；西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院2 周圍血管科，3 呼吸科，陜西省西安市 710061)

肺高壓疾病是一組肺血管疾病的集合，這些疾病有一個(gè)共同特點(diǎn)，即用右心導(dǎo)管測(cè)量靜息時(shí)的平均肺動(dòng)脈壓高于25 mmHg[1]。肺動(dòng)脈高壓屬于肺高壓疾病中的一類[2]，其預(yù)后差，發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，許多研究證實(shí)血管收縮分子和血管舒張分子之間，以及促增殖分子和抑制增殖分子之間存在不平衡，導(dǎo)致肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)和平滑肌細(xì)胞增殖從而引起肺動(dòng)脈高壓[1，3]。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)也稱血清素，是一種重要的血管收縮物質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)。5-HT假說于20世紀(jì)90年代提出，當(dāng)時(shí)有學(xué)者觀察到一些原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者血漿5-HT水平升高；此外，減肥藥誘發(fā)的肺動(dòng)脈高壓被認(rèn)為與其間接的5-HT能效應(yīng)有關(guān)[4]。因此5-HT與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，但具體的機(jī)制需進(jìn)一步研究。本研究探討5-HT及5-HT2A受體拮抗劑對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞瞬時(shí)受體電位通道(transient receptor potential channel,TRPC)/活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cell,NFAT)蛋白表達(dá)的影響，以期為肺動(dòng)脈高壓的機(jī)制研究提供更多參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 胎牛血清購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司，高糖杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)購(gòu)自Thermo Scientific公司，5-HT、5-HT2A受體拮抗劑酮色林、TRPC抑制劑SKF96365購(gòu)自Tocris公司(批號(hào)：3547、0908、1147)， TRPC1抗體、TRPC6抗體購(gòu)自Alomone公司(批號(hào)：ACC-010、ACC-017)，NFATc3抗體購(gòu)自Santa Cruz公司(批號(hào)：sc-8321)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)單抗購(gòu)自Epitomics公司(批號(hào)：2251-1)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司(批號(hào)：ab6721)。ChemiDocTMXRS型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù) 人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(貨號(hào)為 PCS-100-023TM)。將細(xì)胞置于含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于5% CO2、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)，更換為無血清高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后換為含0.2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。分3種方法干預(yù)24 h，每種干預(yù)方法設(shè)5個(gè)濃度梯度及對(duì)照組。3種干預(yù)方法分別為：(1)5-HT，設(shè)濃度梯度為0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、33 μmol/L、100 μmol/L；對(duì)照組不加5-HT。(2)5-HT+酮色林，其中5-HT設(shè)為10 μmol/L，酮色林設(shè)濃度梯度為0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、3.3 μmol/L、10 μmol/L；對(duì)照組只加10 μmol/L 5-HT，不加酮色林。(3)5-HT+SKF96365,其中5-HT設(shè)為10 μmol/L，SKF96365設(shè)濃度梯度為0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、33 μmol/L、100 μmol/L；對(duì)照組只加10 μmol/L 5-HT，不加SKF96365。

1.3 蛋白免疫印跡法測(cè)定TRPC1、TRPC6及NFATc3蛋白表達(dá)情況 培養(yǎng)皿中加入十二烷基硫酸鈉裂解液，用細(xì)胞刮刀收獲細(xì)胞，離心，提取肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉室溫慢搖封閉1 h。加一抗(TRPC1抗體1 ∶200,TRPC6抗體1 ∶200,NFATc3抗體1 ∶100,GAPDH單抗1 ∶1 000)孵育過夜。TBST洗滌后加二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體,1 ∶5 000)室溫慢搖孵育1 h。TBST洗滌后，用化學(xué)發(fā)光法于凝膠成像系統(tǒng)成像。Quantity One軟件進(jìn)行圖像分析。每組3個(gè)樣本，每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度5-HT對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組相比，10 μmol/L、33 μmol/L、100 μmol/L 5-HT組TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白表達(dá)水平均升高(均P<0.05)；與0.1 μmol/L 5-HT組相比，33 μmol/L、100 μmol/L 5-HT組TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白表達(dá)水平均升高(均P<0.05)，10 μmol/L 5-HT組NFATc3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與1 μmol/L 5-HT組相比，10 μmol/L、33 μmol/L 5-HT組NFATc3蛋白表達(dá)水平均升高，100 μmol/L 5-HT組TRPC6及NFATc3蛋白表達(dá)水平均升高(均P<0.05)；與10 μmol/L 5-HT組相比，100 μmol/L 5-HT組NFATc3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見表1及圖1。

表1 不同濃度5-HT作用下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與0.1 μmol/L 5-HT組比較，#P<0.05；與1 μmol/L 5-HT組比較，aP<0.05；與10 μmol/L 5-HT組比較，bP<0.05。

圖1 不同濃度5-HT對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達(dá)水平的影響

2.2 不同濃度酮色林對(duì)5-HT作用下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組比較，0.01 μmol/L酮色林+5-HT組TRPC6蛋白表達(dá)水平降低，1 μmol/L酮色林+5-HT組、3.3 μmol/L酮色林+5-HT組、10 μmol/L酮色林+5-HT組的TRPC6及NFATc3蛋白表達(dá)水平均降低(均P<0.05)；與0.01 μmol/L酮色林+5-HT組比較，10 μmol/L酮色林+5-HT組的NFATc3蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與0.1 μmol/L酮色林+5-HT組比較，1 μmol/L酮色林+10 μmol/L 5-HT組、3.3 μmol/L酮色林+5-HT組、10 μmol/L酮色林+5-HT組的TRPC6蛋白表達(dá)水平均降低(均P<0.05)。見表2及圖2。

表2 不同濃度酮色林對(duì)5-HT作用下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白相對(duì)表達(dá)水平的影響(x±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與0.01 μmol/L酮色林+5-HT組比較，#P<0.05；與0.1 μmol/L酮色林+5-HT組比較，aP<0.05。

圖2 不同濃度5-HT2A受體拮抗劑酮色林對(duì)5-HT作用下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達(dá)水平的影響

2.3 不同濃度SKF96365對(duì)5-HT作用下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組比較，10 μmol/L SKF96365+5-HT組、33 μmol/L SKF96365+5-HT組、100 μmol/L SKF96365+5-HT組TRPC6、NFATc3蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低(均P<0.05)；與0.1 μmol/L SKF96365+5-HT組比較，其余濃度SKF96365+5-HT組TRPC6蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低，且33 μmol/L SKF96365+5-HT組、100 μmol/L SKF96365+5-HT組NFATc3蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低(均P<0.05)；與1 μmol/L SKF96365+5-HT組比較，33 μmol/L SKF96365+5-HT組、100 μmol/L SKF96365+5-HT組TRPC6、NFATc3蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低(均P<0.05)。見表3及圖3。

表3 不同濃度SKF96365對(duì)5-HT作用下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與0.1 μmol/L SKF96365+5-HT比較，#P<0.05；與1 μmol/L SKF96365+5-HT比較，aP<0.05。

圖3 不同濃度SKF96365對(duì)5-HT作用下TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

肺動(dòng)脈高壓的組織學(xué)改變特點(diǎn)是遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈壁內(nèi)呈現(xiàn)廣泛的血管重塑，而肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖是血管重塑的主要表現(xiàn)之一[1，5]。血管活性物質(zhì)和相關(guān)信號(hào)通路是肺動(dòng)脈高壓研究的熱點(diǎn)之一，許多血管活性物質(zhì)參與調(diào)節(jié)肺血管收縮以及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖過程，例如內(nèi)皮素-1、血小板衍生生長(zhǎng)因子、血管生成素、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。血管舒張因子與血管收縮因子之間的失衡被認(rèn)為是肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)[6]。5-HT是一種血管收縮物質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)，也是血管平滑肌細(xì)胞的有絲分裂原，其還參與肺動(dòng)脈高壓進(jìn)展過程中肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和重塑[6]。5-HT通過5-HT受體和轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用[4]。而5-HT2A受體與心血管系統(tǒng)關(guān)系密切，在平滑肌細(xì)胞和血小板中都有分布[7]。有學(xué)者通過高效液相色譜、放射酶學(xué)測(cè)定證實(shí)肺動(dòng)脈高壓患者血漿中的5-HT濃度明顯高于正常人[8-9]。

TRPC和NFAT都是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平和細(xì)胞增殖的重要分子[10-11]。TRPC是細(xì)胞內(nèi)重要的非電壓門控的鈣離子通道，其有7個(gè)亞型，分別為TRPC1～7[10]。TRPC在鈣離子信號(hào)通路調(diào)節(jié)過程中起重要作用[10]，而鈣離子參與調(diào)控細(xì)胞增殖、血管收縮等病理生理過程[12]。在血管平滑肌細(xì)胞中最常檢測(cè)到的TRPC亞型有TRPC1、TRPC4、TRPC6[10]。許多研究證實(shí)TRPC與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。其中，Yu等[13]發(fā)現(xiàn)，在特發(fā)性肺高壓患者的肺組織和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中，TRPC3、TRPC6的mRNA和蛋白表達(dá)較正常壓力或繼發(fā)肺高壓患者的升高，用小干擾RNA抑制TRPC6表達(dá)可顯著降低特發(fā)性肺高壓的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生。肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型中也存在TRPC1、TRPC6等表達(dá)增高的現(xiàn)象[10]。NFAT可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡等多種過程，參與心血管疾病、癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展。NFAT有5個(gè)類型，分別為NFATc1～c5，而參與肺動(dòng)脈高壓病理生理過程的主要有NFATc1、NFATc2、NFATc3，三者在炎癥、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、代謝異常等過程中發(fā)揮作用[14]。在成年小鼠中，NFATc3的激活可增加肺動(dòng)脈壁厚度；NFATc3缺陷的成年小鼠在缺氧條件下右室壓在正常水平；慢性缺氧條件下，在新生小鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中觀察到NFATc3的核積聚現(xiàn)象[14]。因此本研究觀察了5-HT對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，10 μmol/L、33 μmol/L、100 μmol/L 5-HT組TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白表達(dá)水平均升高(均P<0.05)；但10～100 μmol/L的5-HT濃度組中，除了100 μmol/L 5-HT組NFATc3蛋白表達(dá)水平高于10 μmol/L 5-HT組(均P<0.05)，其他不同濃度組間的TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這提示10～100 μmol/L的5-HT可上調(diào)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達(dá)，但在該濃度范圍5-HT對(duì)以上蛋白的上調(diào)作用并無顯著的濃度依賴性。

我們進(jìn)一步觀察5-HT2A受體拮抗劑酮色林對(duì)5-HT干預(yù)作用的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，0.01 μmol/L酮色林+5-HT組TRPC6蛋白表達(dá)水平降低，1 μmol/L酮色林+5-HT組、3.3 μmol/L酮色林+5-HT組、10 μmol/L酮色林+5-HT組的 TRPC6及NFATc3蛋白表達(dá)水平均降低(均P<0.05)，提示濃度為0.01 μmol/L、1～10 μmol/L的5-HT2A受體拮抗劑酮色林，可抑制5-HT上調(diào)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)TRPC6蛋白表達(dá)的作用。許多研究表明5-HT可引起肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加，而使用L型鈣通道(電壓門控鈣通道)阻斷劑并不能抑制5-HT引起的鈣離子變化[15-16]。在心肌細(xì)胞中，非電壓門控的鈣離子通道TRPC1參與了5-HT活化鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/NFAT的過程[17]。本研究還觀察了TRPC通道抑制劑SKF96365對(duì)5-HT作用下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，10 μmol/L SKF96365+5-HT組、33 μmol/L SKF96365+5-HT組、100 μmol/L SKF96365+5-HT組TRPC6、NFATc3蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低(均P<0.05)。這表明10～100 μmol/L的TRPC通道抑制劑SKF96365可以抑制5-HT上調(diào)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC6、NFATc3蛋白表達(dá)的作用。因此我們推測(cè)5-HT可能與TRPC通道存在聯(lián)系，其可能通過直接參與調(diào)節(jié)TRPC通道，促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展。目前關(guān)于5-HT與TRPC通道及相關(guān)信號(hào)通路之間的作用研究較少，值得進(jìn)一步研究。但是，1～10 μmol/L酮色林以及10～100 μmol/L SKF96365，對(duì)TRPC6及NFATc3蛋白表達(dá)水平的影響差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示在一定范圍內(nèi)提高酮色林、SKF96365的干預(yù)濃度可能并不能增強(qiáng)其作用效果，但這有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來驗(yàn)證。

綜上所述，5-HT可上調(diào)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達(dá)，而5-HT2A受體拮抗劑酮色林和TRPC通道抑制劑SKF96365可抑制5-HT對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC6和NFATc3蛋白表達(dá)的影響。5-HT與TRPC通道及相關(guān)信號(hào)通路之間的作用值得進(jìn)一步深入研究，有可能成為肺動(dòng)脈高壓新的治療靶點(diǎn)。