武開樂，庫西塔別克·買買提依不拉音，馬 靜，邵 偉,，余 雄

(l.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，烏魯木齊830052；2.新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)重點試驗室，烏魯木齊830052)

0 引 言

【研究意義】雌激素(estrogen，E)在哺乳動物的生理過程中發(fā)揮著重要作用，其具有抗氧化、提高機體免疫力、促進機體生長發(fā)育等多種生理功能?！厩叭搜芯窟M展】大多數(shù)雌激素對于哺乳動物的研究，都主要集中在對豬和羊繁殖性能的影響[1]，以及雌激素對奶牛泌乳性能[2-3]、乳成分[4]、抗氧化[5]及免疫功能[6]的調(diào)節(jié)上，奶牛乳腺上皮細胞是雌激素在奶牛乳腺中的重要反應器，也是研究乳腺的生長發(fā)育和泌乳機制的重要體外模型。近年來，隨著激素對乳腺上皮細胞功能影響的研究逐漸深入，對于雌激素作用乳腺上皮細胞的機制也逐漸的展開了研究。雌激素主要是通過與乳腺組織中雌激素的特異性受體(estrogenreceptor, ER)的結(jié)合，調(diào)節(jié)乳腺導管和乳腺腺泡的發(fā)育[7]，進而調(diào)節(jié)乳腺上皮細胞的生長發(fā)育?！颈狙芯壳腥朦c】對奶牛乳腺上皮細胞的生長發(fā)育調(diào)控方面的研究卻少之又少。研究雌激素對乳腺上皮細胞增殖及細胞生長周期變化規(guī)律的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞，分析不同濃度雌激素對其生長發(fā)育的影響，為雌激素在細胞分子水平上調(diào)控奶牛乳腺上皮細胞的研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2017年11月至2018年1月,在新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)實驗室進行雌激素對乳腺上皮細胞的增殖及細胞生長周期規(guī)律影響的試驗。

主要儀器為CO2恒溫培養(yǎng)箱、潔凈工作臺、生物倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、離心機、酶標檢測儀、流式細胞儀。

主要試劑為乳腺上皮細胞：購自中國科學院細胞庫、MEBM、胎牛血清(Fetal Bovine Serum/FBS)、核糖核酸酶RNase A、碘化丙啶 PI染液、胰酶Trypsin(Amresco)、PBS、CCK-8(Dojindo)。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

將乳腺上皮細胞復蘇后，添加細胞完全培養(yǎng)基，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，選取擴增生長狀態(tài)良好的乳腺上皮細胞，添加0、50、100、200 μmol/L雌激素孵育BMECs后，分別在0、12、24、48、72 h后采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測各組細胞增殖情況，采用流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期情況。

試驗分為兩組：對照組為單純?nèi)橄偕掀ぜ毎囵B(yǎng)組，試驗組為不同濃度雌激素添加組。

1.2.2 細胞的復蘇及純化

將液氮罐中購買的細胞，用鑷子取出，迅速放在已開啟的37℃的水浴鍋中，不停地在水中晃動，使其在1 min內(nèi)融化。之后將其移至超凈臺內(nèi)，用移液槍接種至25 cm2(T25)的細胞培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)基使其再次生長。在37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細胞融合度達80%時開始進行擴增純化。

1.2.3 細胞的培養(yǎng)

當細胞融合度達80%左右之后，將舊的培養(yǎng)基棄去，用2～3 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗兩遍，加入預熱好的0.25%胰蛋白酶1～2 mL消化，在培養(yǎng)箱中孵育2～3 min，然后取出來在顯微鏡下一邊觀察一邊輕微地彈下培養(yǎng)瓶底部，讓其細胞脫落。在顯微鏡下觀察到大約70%細胞脫落之后，加入完全培養(yǎng)基終止消化。再用移液槍進行輕微吹打?qū)⑵溆嗉毎荡蛳聛?。移至離心管中，在2 000 r/min下離心2 min，小心棄去上清液，加入完全培養(yǎng)基并用移液槍打勻，傳到細胞培養(yǎng)瓶中，正常情況下3 d可以長滿培養(yǎng)瓶內(nèi)部，在此期間可以換一次培養(yǎng)基。按照上述的培養(yǎng)方法，將細胞純化擴增到第3代，在加入不同濃度的雌激素，然后將所有細胞樣進行12、24、48和72 h的培養(yǎng)。

1.2.4 CCK-8細胞

(1)細胞種板：將對數(shù)生長期細胞用胰蛋白酶消化，配制成細胞懸液，按3 000～5 000細胞每孔接種于96孔板，每孔加100 μL，置于CO2(5%)培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)過夜貼壁，邊緣孔用無菌PBS填充。

(2)按具體試驗方案進行藥物處理，每個樣本濃度設3～5個重復。

(3)CCK-8反應：所有孔中分別加入10 μL CCK-8溶液，輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻，培養(yǎng)箱中孵育2 h。

(4)測吸光度值：使用酶標儀測定450 nm光吸收值。

1.2.5 流式周期

(1)收集細胞：棄去上清，加入1 mL PBS清洗一次，棄上清，再加入1 mL 0.25%胰酶消化細胞，待細胞變圓且有部分細胞懸浮，即加入PBS終止消化。用移液槍輕輕吹打細胞，使細胞懸浮。細胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，1 500 /min離心5 min收集細胞。

(2)PBS洗滌細胞：加入3 mL 4℃預冷的PBS完全重懸細胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清。沉淀震蕩混勻。

(3)固定過夜：沉淀中緩慢加入-20℃預冷的75%乙醇，重懸細胞，4℃過夜。

(4)PBS洗滌細胞：加入2 mL PBS混勻后，1 500 /min離心5 min收集細胞，PBS重懸，離心收集細胞。加入100 μL PBS重懸細胞。

(5)去除RNA：加入2 μL濃度為1 mg/mL的RNaseA(去離子水配制)，37℃水浴40 min。

(6)熒光標記：加入100 μL濃度為100 μg/mL 的PI染色液(PBS配制)，避光染色20 min。

(7)上機檢測：流式細胞儀使用激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波(長585±21 )nm進行檢測，用Modfit 軟件分析細胞周期以確定細胞周期分布。

1.2.6 樣品收集

收集對照組及各雌激素濃度添加試驗組在0、12、24、48、72 h各時間點的細胞樣品，每組設3個平行，3個重復，取樣后將細胞樣品先放置于-20℃的冰箱中2 h，后取出放置于-80℃的冰箱過夜，再將過夜后的細胞樣品放入液氮罐中保存。試驗結(jié)束后將樣品送至北京華英生物技術(shù)有限公司檢測細胞增殖及細胞生長周期。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有原始數(shù)據(jù)先用Excel 2016進行整理，用SPSS 22軟件進行單因素方差分析，并用Duncan法進行多重比較。數(shù)據(jù)最終計算資料用平均值±標準差(X ±S)表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準，P<0.01作為差異極顯著判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 觀察奶牛乳腺上皮細胞的形態(tài)

2.1.1 復蘇后乳腺上皮細胞的形態(tài)

研究表明，復蘇后經(jīng)過傳代純化正常生長的奶牛乳腺上皮細胞分布均勻，細胞成片連接，呈鵝卵石樣平鋪瓶底。圖1

圖1 奶牛乳腺上皮細胞復蘇后正常生長形態(tài)(200×)

Fig.1 Morphology of mammary epithelial cells in dairy cows after resuscitation(200×)

2.1.2 各試驗組乳腺上皮細胞形態(tài)

倒置顯微鏡下觀察到12 h時，50 μmol/L雌激素添加組的乳腺上皮細胞融合度最好(95%)，各試驗組細胞成片連接，且呈鵝卵石樣生長(圖2)。24 h時，各試驗組細胞體積變大，呈鵝卵石樣均勻鋪滿瓶底(圖3)。48 h時，各試驗組細胞之間排列緊密，形成集落，聚集生長(圖4)。72 h時，各試驗組細胞細胞生長減緩，細胞數(shù)量減少(圖5)。圖3～5

A：0 μmol/L雌激素添加組；B：50 μmol/L雌激素添加組；C：100 μmol/L雌激素添加組；D：200 μmol/L雌激素添加組

A:0 μmol/L estrogen supplementation group; B:50 μmol/L estrogen supplementation group; C:100 μmol/L estrogen supplementation group; D:200 μmol/L estrogen supplementation group

圖2 12 h時各試驗組細胞生長形態(tài)(200×)

Fig.2 Growth morphology of cells in each experimental group at 12 h (200 ×)

A:0 μmol/L雌激素添加組；B:50 μmol/L雌激素添加組；C:100 μmol/L雌激素添加組；D:200 μmol/L雌激素添加組

A:0 μmol/L estrogen supplementation group; B:50 μmol/L estrogen supplementation group; C:100 μmol/L estrogen supplementation group; D:200 μmol/L estrogen supplementation group

圖3 24 h時各試驗組細胞生長形態(tài)(200×)

Fig.3 Growth morphology of cells in each experimental group at 24 h (200 ×)

A:0 μmol/L雌激素添加組；B:50 μmol/L雌激素添加組；C:100 μmol/L雌激素添加組；D:200 μmol/L雌激素添加組

A:0 μmol/L estrogen supplementation group; B:50 μmol/L estrogen supplementation group; C:100 μmol/L estrogen supplementation group; D:200 μmol/L estrogen supplementation group

圖4 48 h時各試驗組細胞生長形態(tài)(200×)

Fig.2 Growth morphology of cells in each experimental group at 48 h (200 ×)

A:0 μmol/L雌激素添加組；B:50 μmol/L雌激素添加組；C:100 μmol/L雌激素添加組；D:200 μmol/L雌激素添加組

A:0 μmol/L estrogen supplementation group; B:50 μmol/L estrogen supplementation group; C:100 μmol/L estrogen supplementation group; D:200 μmol/L estrogen supplementation group

圖 5 72 h時各試驗組細胞生長形態(tài)(200×)

Fig.5 Growth morphology of cells in each experimental group at 72 h (200 ×)

2.2 細胞增殖

研究表明，對照組在不同雌激素濃度下細胞的OD值無明顯差異；培養(yǎng)12 h時，50 μmoL/L雌激素組的OD值顯著高于對照組及100 μmoL/L雌激素組(P<0.05)，且極顯著高于200 μmoL/L雌激素添加組(P<0.01)；培養(yǎng)24 h時，對照組OD值極顯著高于其他各濃度雌激素添加組(P<0.01)；培養(yǎng)48、72 h時，對照組OD值極顯著高于其他各濃度雌激素添加組(P<0.01)，且100 μmoL/L雌激素組極顯著高于200 μmoL/L雌激素添加組(P<0.01)。其余組間差異均不顯著。

在不添加雌激素時，對照組在48 h時OD值達到最高，極顯著高于其他各時間點(P<0.01)；添加50、100、200 μmoL/L雌激素時，12 h時的OD值極顯著高于其他各時間點(P<0.01)。其余組間差異均不顯著。表1

表1 不同雌激素濃度下不同時間段時對細胞增殖變化

Table 1 Effects of different estrogen concentrations on cell proliferation at different time points

項目Project時間Time (h)濃度(μmoL/L)Concentration01224487200.17±0.01Ga0.90±0.03Cb0.93±0.05Ca1.06±0.06Aa0.79±0.02Ea500.17±0.10Ga0.96±0.02Aa0.74±0.03Cc0.73±0.03Cc0.46±0.01Ec1000.18±0.10Ga0.87±0.03Ab0.73±0.04Cc0.75±0.05Cc0.44±0.01Ec2000.18±0.10Ga0.82±0.07Ac0.66±0.07Cc0.62±0.01Ce0.35±0.01Ee

注：同列數(shù)據(jù)肩標相鄰小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相隔小寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；同行肩標相鄰大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相隔大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

The adjacent lowercase letters of the same column data indicate significant difference (P<0.05), and the lowercase letters indicate that the difference is extremely significant (P<0.01); the adjacent uppercase letters of the shoulders indicate significant difference (P<0.05), which is separated by uppercase letters.The difference was extremely significant (P< 0.01)

2.3 細胞周期

研究表明，對照組在添加不同濃度雌激素時其G1、S、G2期無明顯差異；培養(yǎng)至12 h時，對照組及添加50 μmoL/L雌激素組其G1期極顯著高于其他兩組(P<0.01)，對照組S期極顯著高于其他各組(P<0.01)，添加100 μmoL/L雌激素組其G2期極顯著高于其他各組(P<0.01)；培養(yǎng)至24 h時，添加100、200 μmoL/L雌激素組G1期極顯著高于其他兩組(P<0.01)，添加50 μmoL/L雌激素組S期極顯著高于對照組及其他兩組(P<0.01)，對照組在G2期極顯著高于其他各組(P<0.01)；培養(yǎng)至48 h時，對照組在G1、G2期極顯著高于其他各組(P<0.01)，50、200 μmoL/L在S期極顯著高于對照組及其他組(P<0.01)；培養(yǎng)至72 h時，添加100 μmoL/L雌激素組其G1期極顯著高于對照組及其他各組(P<0.01)，對照組及添加50、200 μmoL/L雌激素組S期顯著高于添加100 μmoL/L雌激素組(P<0.05)，對照組在G2期極顯著高于其他各組(P<0.01)。其余組間差異均不顯著。

不添加雌激素時，細胞培養(yǎng)至48、72 h時其G1期極顯著高于對照組及其他各時間組(P<0.01)，24 h時其S、G2期極顯著高于對照組及其他各組(P<0.01)；在添加50 μmoL/L雌激素時，細胞培養(yǎng)至72 h時其G1期極顯著高于對照組及其他各時間組(P<0.01)，24 h時其S、G2期極顯著高于對照組及其他各組(P<0.01)；在添加100 μmoL/L雌激素時，細胞培養(yǎng)至72 h時其G1期極顯著高于對照組及其他各時間組(P<0.01)，24 h時其S期極顯著高于對照組及其他各組(P<0.01)，12、24 h時其G2期極顯著高于對照組及其他各組(P<0.01)。其余組間差異均不顯著。表2

表2 不同雌激素濃度下不同時間段時對細胞生長周期變化

Table 2 Effects of different estrogen concentrations on cell growth cycle at different time intervals

項目Project濃度(μmoL/L)Concentration時間(h)Time(h)012244872G1059.20±0.87Ca51.05±0.50Ea20.42±0.51Gb62.44±1.01Aa63.12±0.31Ad5059.63±0.84Ca51.10±0.03Ga19.44±0.26Ic53.89±0.16Ee67.59±1.09Ac10059.46±0.52Ca45.15±0.16Gb29.67±0.48Ia55.14±0.45Ece71.59±0.13Aa20059.64±0.32Ca44.64±0.12Gb30.29±0.60Ia56.65±1.34Ec69.01±0.01AbS019.82±0.29Ea32.73±1.08Ca45.48±0.08Ac19.87±0.86Ee20.11±1.69Eab5019.88±0.32Ga22.49±1.18Ee52.98±0.98Aa35.92±1.59Ca19.80±1.38Gab10019.65±0.40Ga24.77±0.10Ec39.65±2.66Ad29.80±0.41Cc18.87±0.08Gb20019.82±0.66Ga25.18±0.33Ec40.35±2.88Ad33.85±1.29Ca21.16±0.01GaG2020.97±0.68Ca16.21±1.58Ee34.10±0.42Aa17.68±0.14Ea16.77±1.38Ea5020.48±1.15Ea24.91±0.35Cc27.57±1.24Ac10.13±1.37Ge12.61±0.29Ic10020.88±0.91Ca30.07±0.05Aa30.66±2.17Ac15.05±0.04Ec9.54±0.21Ge20020.53±0.53Ca30.16±0.21Ac29.35±2.27Ab9.49±0.05Ee9.83±0.01Ee

注：同列數(shù)據(jù)肩標相鄰小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相隔小寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；同行肩標相鄰大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相隔大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

The adjacent lowercase letters of the same column data indicate significant difference (P<0.05), and the lowercase letters indicate that the difference is extremely significant (P<0.01); the adjacent uppercase letters of the shoulders indicate significant difference (P<0.05), which is separated by uppercase letters.The difference was extremely significant (P< 0.01)

3 討 論

3.1 雌激素對細胞增殖的影響

試驗研究表明，添加雌激素與對照組相比可以促進乳腺上皮細胞的增殖。乳腺上皮細胞是乳腺實質(zhì)的腺泡和導管系統(tǒng)的重要組成部分[8]，是研究乳腺生長發(fā)育和泌乳機制的重要體外模型。激素對乳腺上皮細胞功能影響的研究在近年來逐漸深入，雌激素可能通過自分泌或旁分泌的方式，誘導乳腺上皮細胞分泌其他生長因子[9-10]，然后進入到血液中，發(fā)揮促進乳腺上皮細胞增殖的作用。研究表明雌激素可以促進乳腺上皮細胞的增殖[11-12]。穆瑩等[13]的研究表明，與對照組相比，添加大豆異黃酮組奶牛乳腺上皮細胞的增殖能力與活力顯著增強。劉春龍等[14]的研究表明,大豆異黃酮在一定濃度范圍內(nèi)有促進奶牛乳腺上皮細胞增殖及提高抗氧化水平的作用。與試驗的研究結(jié)果一致。

低濃度50 μmoL/L雌激素具有促進牛乳腺上皮細胞增殖的作用，但在高濃度100 、200 μmoL/L雌激素環(huán)境下，細胞增殖的能力極顯著低于對照組?？赡苁谴罅康拇萍に嘏c其特異性受體發(fā)生了結(jié)合，使由旁分泌產(chǎn)生的生長因子大量的增加，出現(xiàn)了高濃度的雌激素抑制細胞增殖的現(xiàn)象。陳靜、Vandenberg、曹艷紅[15-17]等的研究表明，低濃度的雌激素能夠促進奶牛乳腺上皮細胞的增殖，高濃度可以對奶牛乳腺上皮細胞造成損傷。

試驗中，添加50 μmoL/L雌激素組在12 h時與對照組相比顯著促進乳腺上皮細胞的增殖，而在24、48、72 h時與對照組相比極顯著的抑制了乳腺上皮細胞的增殖?？赡艿脑蛴袃煞N：一是可能因為乳腺上皮細胞在添加雌激素后，隨著培養(yǎng)的時間延長，其細胞自身分泌的雌激素量在逐漸的增加，雌激素的濃度變高，出現(xiàn)了高濃度雌激素抑制乳腺上皮細胞增殖的現(xiàn)象；其二可能是因為通過旁分泌和自分泌形式產(chǎn)生的其他大量的生長因子和細胞的代謝物的不斷增加，消耗了細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，出現(xiàn)了這些生長因子、代謝物與乳腺上皮細胞競爭性抑制的現(xiàn)象，負向調(diào)節(jié)了雌激素促進乳腺上皮細胞增殖的作用。陳靜、Vandenberg[15-16]等的研究表明，乳腺上皮細胞的增殖作用與雌激素的添加劑量和作用時間的長短有關(guān)，與試驗的研究結(jié)果一致。

3.2 雌激素對細胞生長周期的影響

試驗研究結(jié)果表明，添加雌激素后，乳腺上皮細胞在細胞生長各時期其基本的生長規(guī)律與對照組相一致，可能是因為乳腺上皮細胞自身的生長周期規(guī)律不受外界激素或其他生長因子等所影響。在整個細胞周期過程中，細胞都要經(jīng)歷由G1-S-G2-M期的歷程[18]。

在12 h時，各濃度雌激素添加組與對照組相比其細胞周期極顯著的由G1、S期轉(zhuǎn)向了G2期，G2期的細胞比例快速上升，大量的細胞停留在這個時期?？赡苁谴萍に氐奶砑蛹涌炝思毎挠薪z分裂，促進了細胞的增殖。陳秀霞等[19]研究發(fā)現(xiàn)雌、雄激素聯(lián)合作用還能促進G2/M期細胞增多，可能是通過加快細胞周期進程從而促進成骨細胞的增殖和分化。

在12 h時，100、200 μmoL/L雌激素添加組G1期顯著高于50 μmoL/L雌激素添加組，S期、G2期極顯著高于50 μmoL/L雌激素添加組。說明高濃度的雌激素在一定的時間下可以加快細胞周期G1期向S、G2期的轉(zhuǎn)化。但此時各濃度雌激素通過復雜的信號系統(tǒng)對細胞周期的影響有待于進一步深入研究。

試驗中，在24、72 h時各濃度雌激素組的細胞生長周期相比于對照組顯著的阻滯在G1期，48 h時各濃度雌激素組的細胞生長周期相比于對照組極顯著的阻滯在S期?？赡茉蛴袃煞N，由于雌激素的濃度隨著時間的增加變高后，一是可能是高濃度雌激素通過誘導乳腺上皮凋亡并將細胞阻滯在G1期，使細胞不能進入S期進行DNA合成，最終使乳腺上皮細胞的體外增殖受到抑制；其二可能是細胞內(nèi)的DNA發(fā)生了損傷，細胞開始啟動損傷感應機制[20-21]，使細胞的生長發(fā)生了阻滯，而后開始DNA修復，修復完成后的細胞方能進入下一個周期，在此過程中，修復不成功的細胞則會出現(xiàn)凋亡。

4 結(jié) 論

添加雌激素可以促進奶牛乳腺上皮細胞的增殖；且在50、100、200 μmoL/L這三種濃度的雌激素添加組中，50 μmoL/L雌激素添加組在12 h時促進乳腺上皮細胞增殖的效果最好，細胞的增殖情況比0 μmoL/L雌激素添加組增高了6.25%，其他各添加組在不同時間點均抑制了奶牛乳腺上皮細胞的增殖，且隨著濃度和時間的不斷增加，細胞的增殖能力不斷減弱。

添加雌激素不影響奶牛乳腺上皮細胞在各時期時細胞生長的基本規(guī)律。在12 h時，各濃度雌激素添加組的細胞周期由G1、S期向G2期轉(zhuǎn)化較快，且100、200 μmoL/L高濃度雌激素添加組比50 μmoL/L低濃度雌激素添加組轉(zhuǎn)化較快；在24、48 h時，各濃度雌激素添加組的細胞周期被阻滯在S期；在72 h時，各濃度雌激素添加組的細胞周期被阻滯在G1期。