丁建朋，范瑛閣，姚永生

(塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾，843300)

0 引 言

【研究意義】2017年新疆棉花種植面積196.3×104hm2，總產(chǎn)量408.2×104t，分別占全國的60.8%和74.4%[1-2]。由于大面積種植以及多年連作，棉花枯萎病發(fā)生日益嚴(yán)重，而長期借助多菌靈、百菌清等進(jìn)行化學(xué)防治，致使病原菌抗藥性不斷提高，防控越來越困難，也對環(huán)境造成了污染[3-5]，嚴(yán)重制約著新疆棉花的可持續(xù)發(fā)展。篩選對尖孢鐮刀菌具有拮抗作用的微生物，對棉花枯萎病的生物防治具有重要意義[6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】生物防治因其對環(huán)境友好、人畜安全性高及作用靶標(biāo)專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是目前生產(chǎn)中較為安全有效的防控措施，利用拮抗微生物進(jìn)行生物防治符合保護(hù)生態(tài)環(huán)境的需求，為農(nóng)業(yè)有害生物綠色防控和可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)保障[7]。具有拮抗作用的微生物在維持土壤微生物群落結(jié)構(gòu)平衡中起著重要作用，已報(bào)道對尖孢鐮刀菌有拮抗作用的微生物主要有木霉菌Trichodermaspp.、解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens和枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis等[6,8-10]，其中木霉菌防治棉花枯萎病取得了良好的防效?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】應(yīng)用拮抗微生物對防治病害可有效減少農(nóng)藥對環(huán)境的污染，是極具潛力的發(fā)展方向[11-12]。研究分離篩選對棉花枯萎病有抑制作用的微生物，并進(jìn)行鑒定?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究以一株南疆半沙漠化、半鹽堿化環(huán)境中分離的生防菌HFW217為目標(biāo)，通過16S rDNA和生理生化方法，對其進(jìn)行鑒定，并測定其對棉花枯萎病的溫室和田間藥效，可為防控棉花枯萎病的生物農(nóng)藥開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 生防菌

生防菌HFW217，從阿拉爾周邊長勢良好的棉田植株根際土壤中分離而來。

1.1.2 試劑

DNA Marker、Goldview I型核酸染料、Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒及2×EsTaqMasterMix分別購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司、北京索萊寶科技有限公司和上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 引物

細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增參考采用通用引物27F/1492R；芽孢桿菌rpoB基因特異性引物按照引物設(shè)計(jì)原則以Genbank中6株標(biāo)準(zhǔn)芽孢桿菌rpoB基因組序列為參考，試驗(yàn)引物序列(由上海生工生物工程有限公司合成)。表1

表1 鑒定所需PCR引物序列

Table 1 PCR primers used for species identification

目標(biāo)基因Target gene引物Primer核苷酸序列Nucleotide sequence 5’-3’16S rDNA27FAGAGTTTGATCCTGGCTC1492RCGGCTACCTTGTTACGACTTrpoBHr-fAGGTCAACTAGTTCAGTATGGACHr-rAAGAACCATAACCGGCAACTT

1.1.4 供試棉花

供試棉花：品種圍為新陸中54號。

對照藥劑：80%多菌靈WP(石家莊亞潤科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))，按照使用說明配制1 500倍液。

1.1.5 發(fā)酵液與發(fā)酵液的制備

生防菌發(fā)酵液為LB培養(yǎng)基不加瓊脂，將HFW217在發(fā)酵液中28℃，12/24 h光照培養(yǎng)24 h后，按1∶20的比例再次接種到發(fā)酵液中28℃，180 rpm/min，振蕩培養(yǎng)4 d備用。

1.2 方 法

1.2.1 生防菌HFW217的生理生化測定

生防菌HFW217的生理生化鑒定包括培養(yǎng)性狀、生理和生化測定三個(gè)方面，利用掃描電鏡對菌株形態(tài)和大小進(jìn)行測定，其它指標(biāo)參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]中記載的方法進(jìn)行。

1.2.2 生防菌HFW217的16S rDNA分子序列測定

1.2.2.1 細(xì)菌基因組DNA提取

改良酚氯仿法；從新鮮培養(yǎng)物中刮取足量的菌體于離心管中，加入200 μL 10×TE和20 μL 50 mg/mL溶菌酶溶解，于37 ℃ 180 rpm條件下恒溫?fù)u床震蕩4 h，至酶解徹底。取出后加入20% SDS 50 μL、蛋白酶K(20 mg/mL)5 μL ，60℃條件下水浴2 h，取出后加入1/10體積CTAB/NaCl，并補(bǔ)加5 mol/LNaCl至終濃度0.5 mol/L，混勻后等體積加入氯仿/異戊醇，12 000 r/min離心10 min，取上清置新離心管加1/10體積的3 mol/LNaCl，再加2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，于-20℃條件下沉淀DNA過夜，取出后12 000 r/min離心10 min，倒去上清，加入70%冰乙醇洗滌2～3次，干燥后加入100 μL 10×TE重新溶解，置于-20 ℃條件下保存。

Ezup柱式法：方法采用改進(jìn)的SDS-CTAB法?；蚪MDNA提取參照Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書操作進(jìn)行，對提取后的基因組DNA用10×TE溶解后，置于-20℃條件下保存。

1.2.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

向無菌PCR管內(nèi)加入25 μL PCR mastermix，4 μL模板，上下游引物各2 μL，并補(bǔ)足ddH2O，制成50 μL PCR體系。PCR反應(yīng)設(shè)陽性對照PCR管1支，空白(陰性)對照1支，待測樣品2支。

PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性1 min，52℃引物復(fù)性90 s，72℃延伸3 min，共進(jìn)行35個(gè)重復(fù)，最后72℃延伸10 min[19]。

1.2.2.3 PCR結(jié)果的電泳檢測

用1×TAE配置1%瓊脂糖凝膠，溶后待冷卻至不燙手時(shí)(約55℃)加入goldview II 染色劑至終濃度為0.5‰，制膠。將凝固完全的膠放入電泳槽，使電泳液高出凝膠約1 mm，進(jìn)行點(diǎn)樣，點(diǎn)樣完成后于110 V恒壓電泳35 min，取出后置于凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行拍照。

1.2.2.4 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹繪制

對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，利用BLAST軟件對測序獲得的16S rDNA序列與Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，并在Clustal X(1.8)程序中對相近序列進(jìn)行多重序列匹配排列(Multiple alignments)分析，用Neighbor-Joining法構(gòu)建基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 生防菌HFW217溫室和田間防效測定

溫室試驗(yàn)在塔里木大學(xué)植保站溫室中進(jìn)行。選取長勢一致的棉花苗在兩葉一心期接種棉花枯萎病菌，待棉花葉片出現(xiàn)零星病斑時(shí)開始噴藥。每隔7 d噴藥一次，共噴藥3次，在第一次噴藥之前和最后一次噴藥后7 d統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)和防治效果，計(jì)算方法參照參考文獻(xiàn)[14]。計(jì)算結(jié)果用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析5%水平的差異顯著性。田間防效試驗(yàn)設(shè)在塔里木大學(xué)植物保護(hù)試驗(yàn)田，處理及數(shù)據(jù)分析參照溫室試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌HFW217的生理生化測定

2.1.1 菌落形態(tài)

HFW217菌株在LB上的菌落形態(tài)顯示，菌落隆起有皺褶，淡黃色不透明，粘稠有臭味，無水溶性色素，單菌落形態(tài)為近圓形。圖1

圖1 HFW217在LB培養(yǎng)基上的培養(yǎng)形狀

Fig.1 Culture shape of HFW217 on LB medium

圖2 HFW217掃描電鏡圖片

Fig.2 Scanning electron microscopy picture of HFW217

2.1.2 菌體形態(tài)與大小

HFW217菌株的菌體形態(tài)為短桿狀，大小為(0.5～0.8)×(1.1～3.0)μm。圖2

2.1.3 生理測定

HFW217芽孢呈橢圓形，著生于菌體中部，無鞭毛，革蘭氏染色為陽性菌，可耐受45℃的高溫和15℃的低溫；HFW217在無鹽狀態(tài)以及11%鹽濃度下均可生長。HFW217在葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中生長優(yōu)于以甘露醇為碳源的培養(yǎng)基，在硝酸鉀、硝酸銨，草酸銨為氮源的培養(yǎng)基中均生長不良。表2，表3

表2 HFW217生長溫度

Table 2 Growth temperature of HFW217

溫度Temperature/℃HFW21710﹣15﹢25﹢28﹢35﹢40﹢45﹢50﹣55﹣

注：，陽性反應(yīng)；-，陰性反應(yīng)

Note:, positive reaction; -, negative reaction

表3 HFW217的耐鹽性試驗(yàn)

Table 3 Salt tolerance test of HFW217

NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Mass fraction of NaCl/(%)HFW2170﹢2﹢5﹢7﹢10﹢11﹢12﹣

注：，陽性反應(yīng)；-，陰性反應(yīng)

Note:, positive reaction; -, negative reaction

2.1.4 生化鑒定

研究表明，硝酸鹽還原和過氧化氫酶均為陽性，葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸，水解淀粉、明膠，pH 6.8和pH 5.7下均能生長，不產(chǎn)生吲哚，不水解卵磷脂，不形成二羥基丙酮，孢囊膨大，不能水解酪素，不能利用檸檬酸鹽，能發(fā)酵L-阿拉伯糖、D-木糖和甘露醇。

結(jié)合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，HFW217與解淀粉芽胞桿菌的描述最相近，鑒定為解淀粉芽胞桿菌。表4

表4 HFW217生化測定

Table 4 Biochemical test results of HFW217

特征 CharacteristicHFW217特征 CharacteristicHFW217細(xì)胞直徑>1.0 μmCell diameter>1.0 μm﹣卵黃卵磷脂Yolk lecithin﹣芽孢形狀Spore shape橢圓明膠液化Gelatin liquefaction﹢孢囊膨大Cyst enlargement﹢利用檸檬酸鹽Utilization of citrate﹣過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)Catalase experiment﹢L-阿拉伯糖L-pectinose﹢硝酸鹽還原Nitrate reduction﹢甘露醇Mannitol﹢產(chǎn)生吲哚Indole production﹣發(fā)酵D-葡萄糖Fermentation of D-glucose﹢脲酶實(shí)驗(yàn)Urease experiment﹢D-木糖D- xylose﹢水解淀粉Hydrolyzes starch﹢生長PH: 6.8 營養(yǎng)肉湯Growing PH: 6.8 nutritional broth﹢酪素水解Casein hydrolysis﹣生長PH: 5.7 營養(yǎng)肉湯Growing PH: 5.7 nutritional broth﹢

注：，陽性反應(yīng)；﹣，陰性反應(yīng)

Note: +, positive reaction; -, negative reaction

2.2 HFW217的基因檢測

2.2.1 HFW217的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測

經(jīng)電泳檢測16S rDNA大小在1 400～1 600 bp(圖3a)，對上海生工測序結(jié)果讀圖和拼接后得16S rDNA序列1 455 bp。采用芽孢桿菌特異性rpoB引物擴(kuò)增在500～600 bp范圍內(nèi)有擴(kuò)增產(chǎn)物(圖3b)，對上海生工測序結(jié)果讀圖后得rpoB基因序列557 bp。圖3

2.2.2 16S rDNA序列比對與同源性

HFW217菌株16S rDNA基因序列與47株芽孢桿菌科細(xì)菌相似性在91%以上。相似性在92.36%～99.72%的有43株，均為芽孢桿菌屬；2株為枝芽孢桿菌屬，相似性為93%；1株為耐鹽短桿菌，相似性為98.90%；株為乳桿菌屬，相似性為91.67%。序列相似性大于95%和97%的菌株除一株耐鹽短桿菌外，其余均為芽孢桿菌屬細(xì)菌。16S rDNA基因序列相似性位列前三的分別為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和西姆芽孢桿菌。列出序列相似性>95%的結(jié)果。表5

圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果(1%瓊脂糖凝膠)

Fig.3 The result of electrophoresis for PCR amplification products with 1% agarose gel

表5 HFW217菌株16S rDNA序列比對

Table 5 The alignment for 16S rDNA of strain HFW217

序號Rank名稱Name菌株編號Strain登錄號Accession相似性Similarity(%)1Bacillus methylotrophicusCBMB205(T)EU194 89799.722Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarumFZB42(T)CP000 56099.453Bacillus siamensisKCTC13 613(T)AJVF01 000 04399.384Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciensDSM7(T)FN597 64499.115Bacillus subtilis subsp. subtilisNCIB3 610(T)ABQL01 000 00199.116Brevibacterium halotoleransDSM8 802(T)AM747 81298.907Bacillus atrophaeusJCM9 070(T)AB021 18198.908Bacillus vallismortisDV1-F-3(T)JH600 27398.839Bacillus mojavensisRO-H-1(T)JH600 28098.8310Bacillus subtilis subsp. spizizeniiNRRLB-23 049(T)CP002 90598.7611Bacillus licheniformisATCC14 580(T)AE017 33397.5912Bacillus aerius24K(T)AJ831 84397.3813Bacillus stratosphericus41KF2a(T)AJ831 84196.8414Bacillus aerophilus28K(T)AJ831 84496.8415Bacillus pumilusATCC7061(T)ABRX01 000 00796.5616Bacillus vietnamensis15-1(T)AB099 70895.6417Bacillus aquimarisTF-12(T)AF483 62595.3218Bacillus acidicola105-2(T)AF547 20995.1119Bacillus marisflaviTF-11(T)AF483 62495.0520Bacillus shackletoniiLMG18 435(T)AJ250 31895.04

2.2.3 rpoB基因的序列比對與同源性

HFW217菌株rpoB基因序列比對相似性大于91%的有101株，其中97%的菌株提示為芽孢桿菌屬?；蛳嗨菩源笥?7%的菌株除2例提示為枝芽孢桿菌屬，相似性在99.4%～99.6%以外，其它顯示均為芽孢桿菌屬菌株，其中解淀粉芽孢桿菌及其亞種、枯草芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌出現(xiàn)較多。序列相似性100%的9株菌株中8株為解淀粉芽孢桿菌及其亞種，1株為芽孢桿菌屬，其分類學(xué)尚不明確。

2.2.4 16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

研究表明，從遺傳進(jìn)化關(guān)系上，HFW217與解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌等共屬一個(gè)進(jìn)化分支。經(jīng)1 000次重復(fù)檢驗(yàn)中，一致的分支數(shù)值均不足70[11]，不能從16S rDNA角度判斷HFW217具體為解淀粉芽孢桿菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌等其中哪一種。對HFW217菌株16S進(jìn)化樹中出現(xiàn)的菌株分別進(jìn)行分子鐘檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與HFW217菌株16S rDNA基因處于同一進(jìn)化分支上的各菌株經(jīng)χ2檢驗(yàn)P>0.05，均能接受具有相同分子進(jìn)化速率的假說。圖4

2.2.5 rpoB基因系統(tǒng)發(fā)育樹

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載的同源性高于97%的菌株rpoB基因，構(gòu)建Neighbour-Joining Tree。HFW217與解淀粉芽孢桿菌處于同一進(jìn)化分支，并且與兩株解淀粉芽孢桿菌普魯蘭酶亞種Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarum具有相同的進(jìn)化距離。與HFW217同樣具有相同進(jìn)化距離的一株枯草芽孢桿菌916菌株，從分子進(jìn)化角度也靠近解淀粉芽孢桿菌。結(jié)合兩個(gè)進(jìn)化樹分析，菌株HFW217可能與當(dāng)前農(nóng)業(yè)生防已廣泛應(yīng)用的解淀粉芽孢桿菌FZB42菌株[11]有更近的物種關(guān)系。在對HFW217與其rpoB基因進(jìn)化樹中出現(xiàn)的菌株進(jìn)行分子鐘檢驗(yàn)，其中唯一差異位點(diǎn)數(shù)最少的為與HFW217處于同一進(jìn)化分支的三株菌株，經(jīng)χ2檢驗(yàn)可以接受HFW217與解淀粉芽孢桿菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌具有相同分子進(jìn)化速率的假設(shè)。其中經(jīng)檢驗(yàn)得HFW217與解淀粉芽孢桿菌UCMB5113和FZB42在卡方檢驗(yàn)中P=1接受具有相同分子速率的假設(shè)。圖5

圖4 HFW217菌株16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(臨位連接法)

Fig.4 Phylogeny tree for 16S rDNA of strain HFW217 (Neighbour-joining)

圖5 HFW217菌株rpoB基因系統(tǒng)發(fā)育樹(臨位連接法)

Fig.5 Phylogeny tree for rpoB gene of strain HFW217 (Neighbour-joining)

2.3 生防菌HFW217對棉花枯萎病的溫室和田間防效

研究表明，菌株HFW217對棉花枯萎病的預(yù)防效果可達(dá)81.80%，治療效果為74.62%，預(yù)防效果高于發(fā)病后的治療效果；而田間試驗(yàn)菌株HFW217對棉花枯萎病的預(yù)防效果80.97%，治療效果為73.18%，預(yù)防效果也高于發(fā)病后的治療效果。與對照藥劑多菌靈相比，生防菌HFW217的預(yù)防效果和治療效果均較為顯著。表6，表7

表6 生防菌HFW217對棉花枯萎病的溫室防治效果

Table 6 The biological control efficacy of the strain A13 against cotton Fusarium wilt in greenhouse

處理Treatment預(yù)防 Prevention治療 ControlHFW217多菌靈Carbendazim無菌水Sterilized waterHFW217多菌靈Carbendazim無菌水Sterilized water處理前病指Pre-treatment disease index---15.3315.3515.47處理后病指Post-treatment disease finger13.8817.3676.2821.6524.4185.79防治效果Control efficiency81.80a77.24b-74.62c66.75d-

表7 生防菌HFW217對棉花枯萎病的田間防治效果

Table 7 The biological control efficacy of the strain A13 against cotton Fusarium wilt in field

處理Treatment預(yù)防 Prevention治療 ControlHFW217多菌靈Carbendazim無菌水Sterilized waterHFW217多菌靈Carbendazim無菌水Sterilized water處理前病指Pre-treatment disease index---16.3616.8316.71處理后病指Post-treatment disease finger15.6721.7782.3623.3125.8988.34防治效果Control efficiency80.97a73.57b-73.18b70.97c-

3 討 論

結(jié)合生理生化和16S rDNA以及rpoB基因序列比對和遺傳進(jìn)化分析，認(rèn)為菌株HFW217屬于解淀粉芽孢桿菌，從基因水平分析，HFW217的親緣關(guān)系上可能與解淀粉芽孢桿菌普魯蘭酶亞種的親緣關(guān)系最近。通過生理試驗(yàn)測定，發(fā)現(xiàn)這株解淀粉芽孢桿菌能夠在鹽濃度為11%和45℃培養(yǎng)條件下生長，比較符合HFW217來源于南疆鹽堿土壤的生活環(huán)境，也比較容易在南疆田間環(huán)境發(fā)揮生防作用。通過溫室和田間試驗(yàn)分析，HFW217對棉花枯萎病防效顯著。

與解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌及甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌等多個(gè)芽孢桿菌相比，菌株HFW217的16S基因序列相似性極高，在分類學(xué)上很難將其區(qū)分。與耐鹽短桿菌在基因序列上也存在很高的相似性，通過早期對菌株HFW217的形態(tài)學(xué)和生理生化的研究發(fā)現(xiàn)HFW217是一株產(chǎn)芽孢革蘭陽性細(xì)菌，可以與不產(chǎn)芽孢的耐鹽短桿菌區(qū)分開。HFW217菌株的rpoB基因較16S rDNA序列相似性更高，最高達(dá)到100%，從rpoB基因進(jìn)化距離估算和進(jìn)化樹分析，菌株HFW217 與解淀粉芽孢桿菌具有穩(wěn)定一致的分子進(jìn)化關(guān)系[15]。雖然從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載的BucillussubtilisStr.916在NCBI數(shù)據(jù)庫分類為枯草芽孢桿菌，但綜合rpoB基因進(jìn)化樹結(jié)果可以看出，枯草芽孢桿菌916菌株分子進(jìn)化關(guān)系也更靠近解淀粉芽孢桿菌，這與歐洲數(shù)據(jù)庫(ezGenome)提示的分類學(xué)關(guān)系一致。從rpoB基因進(jìn)化情況還可以判斷，HFW217與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌相比具有更長的進(jìn)化距離，從進(jìn)化角度可以排除HFW217為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌。其他在兩種基因比較和進(jìn)化分析選擇中并未同時(shí)出現(xiàn)的菌種和菌株無法更詳細(xì)判斷種間進(jìn)化關(guān)系遠(yuǎn)近。

對于芽孢桿菌近緣種間鑒定僅從序列的相似性較難判斷親緣關(guān)系，必要時(shí)需要結(jié)合形態(tài)學(xué)的觀察，如該例鑒定中對耐鹽短桿菌的排除。其次，16S rDNA基因序列在對芽孢桿菌屬內(nèi)近緣種間關(guān)系的判斷并不如rpoB基因?qū)@種近緣種關(guān)系判斷具有更大的貢獻(xiàn)，這與基因分子中種的基因獨(dú)特性相關(guān)。從進(jìn)化的估計(jì)來看，16S rDNA序列過于保守，序列系統(tǒng)發(fā)育樹分支冗余，在親緣較近的種，如解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等表現(xiàn)出的進(jìn)化距離相同，給種的鑒定增加了較多不確定性。相比16S rDNA基因，rpoB基因雖然具有更大基因分子獨(dú)特性，但難以尋找如16S rDNA擴(kuò)增使用的通用引物，需要針對特定屬或若干種進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

由于芽孢桿菌產(chǎn)芽孢的特性，這成為研究之前其他形態(tài)學(xué)和生理生化研究工作區(qū)分芽孢桿菌與非芽孢桿菌的主要依據(jù)，而生理生化和形態(tài)學(xué)研究并不能直接具體確定芽孢桿菌屬具體的種，這主要與芽孢桿菌近緣種具有極相似的生理生化特性相關(guān)。研究方法中16S rDNA基因的研究為選擇特異性的引物提供了主要參考依據(jù)，而單獨(dú)對于芽孢桿菌16S rDNA在芽孢桿菌近緣種中的鑒定貢獻(xiàn)并不明顯。研究原計(jì)劃從16S rDNA、rpoB、gyrB三個(gè)基因著手開展鑒定工作并比較三個(gè)不同基因區(qū)段對于細(xì)菌鑒定的貢獻(xiàn)，但gyrB基因的擴(kuò)增一直未能設(shè)計(jì)篩選出合適的引物，從國內(nèi)外研究的比較中可以得出gyrB基因?qū)τ诩?xì)菌鑒定的敏感性可能不如rpoB基因，但從芽孢桿菌已知菌株gyrB基因區(qū)域中單核苷酸多態(tài)性較豐富的表現(xiàn)，gyrB基因可能在芽孢桿菌近緣種的鑒定中具有較大貢獻(xiàn)。gyrB基因和rpoB基因利用其單核苷酸多態(tài)性的特性在鑒定工作中的貢獻(xiàn)在國內(nèi)外其他臨床微生物的研究中貢獻(xiàn)也有體現(xiàn)，如諾卡氏菌種[16]。進(jìn)化分析對基因序列的比對分析使用的MEGA6.06較MEGA5.0除了繼承之前的算法以外，在進(jìn)化距離估計(jì)和相關(guān)性的分析提供更多的便利以及引入科學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)算法直觀呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析結(jié)果比較同一進(jìn)化分支和不同進(jìn)化分支的關(guān)系[17]。

解淀粉芽孢桿菌對多種植物病害都有一定的抑制作用，是一類重要具有生物防治作用的芽孢桿菌，例如對香蕉枯萎病[18]、油菜核盤菌[19]、尖孢鐮刀菌[6]、草莓蛇病菌[20]、大花惠蘭根腐病[21]、辣椒疫霉[22]、水稻細(xì)菌性條斑病[23]、馬鈴薯枯萎病菌和炭疽病菌[24]、大豆根腐病[25]、炭疽病[26]等都有不同程度的抑制作用。目前，解淀粉芽孢桿菌作為農(nóng)藥中的殺菌劑已在生產(chǎn)中應(yīng)用，陜西加倫多生產(chǎn)的10億活芽孢/克可濕性粉劑被登記用于防治水稻稻瘟病[27-28]。研究中，解淀粉芽孢桿菌對棉花枯萎病的溫室和田間防效顯著，與以往研究不同的是，解淀粉芽孢桿菌HFW217從南疆半沙漠化、半鹽堿化生態(tài)環(huán)境中分離而來，能夠耐受新疆干旱、鹽堿和寒冷等自然條件，具有抗逆特性。

4 結(jié) 論

與多個(gè)芽孢桿菌相比，HFW217菌株的16S rDNA基因序列與43株芽孢桿菌科細(xì)菌相似性92.36%～99.72%；而16S rDNA進(jìn)化關(guān)系上，菌株HFW217與枯草芽孢桿菌、西姆芽孢桿菌等在分類學(xué)上也很難區(qū)分。HFW217菌株的rpoB基因較16S rDNA序列相似性更高，序列相似性100%的9株菌株中8株為解淀粉芽孢桿菌及其亞種，1株為芽孢桿菌屬。采用16S rDNA、rpoB基因序列和生理生化結(jié)合的方法對HFW217進(jìn)行鑒定，其結(jié)果是該生防菌是解淀粉芽孢桿菌B.amloliquefaciens。菌株HFW217在溫室和田間對棉花枯萎病的預(yù)防效果為81.80%和80.97%，防治效果分別為77.62%和73.18%，均明顯高于對照藥劑，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。