王利平

(內(nèi)蒙古烏蘭察布市涼城縣第一中學(xué) 烏蘭察布 013750)

人教版高中生物學(xué)教材有3次提到了囊性纖維化及其病因，介紹都較為簡(jiǎn)略。為什么氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)異常會(huì)導(dǎo)致支氣管中黏液增多？為什么汗液中氯離子和鈉離子的濃度會(huì)升高？1987年，世界著名分子遺傳學(xué)家徐立之(Lap-Chee Tsui)等[1]將囊性纖維化(CF)致病基因定位于人類的第7號(hào)染色體長(zhǎng)臂。1989年，Riordan等[2]在尋找CF疾病基因時(shí)意外發(fā)現(xiàn)了囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)，并且首先克隆了CFTR基因。1991年，CFTR被確定為氯離子選擇性通道，從而開始了對(duì)CFTR作為氯離子通道的系統(tǒng)研究。

1 CFTR的結(jié)構(gòu)

CFTR氯離子通道是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族中的一員。CFTR基因位于人類的第7號(hào)常染色體長(zhǎng)臂(7q31.2)上，全長(zhǎng)250 000 bp，包含27個(gè)外顯子，成熟的mRNA長(zhǎng)度為6129個(gè)堿基，其中4443為可編碼序列，成熟的CFTR糖蛋白全長(zhǎng)1480個(gè)氨基酸殘基。CFTR包含5個(gè)結(jié)構(gòu)域(圖1)，2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域MSD1和MSD2、 2個(gè)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域NBD1和NBD2、 1個(gè)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域R。每個(gè)MSD含有6個(gè)跨膜的α螺旋，這6個(gè)螺旋組成了氯離子通道。每個(gè)NBD都含有保守的Walker A、 WalkerB和LSGGQ基序。Walker A和Walker B基序能與ATP結(jié)合，并通過(guò)ATP結(jié)合、水解調(diào)節(jié)氯離子通道的門控性。調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域R含有蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)所共有的磷酸化位點(diǎn)以及許多帶電的氨基酸，當(dāng)R被PKA磷酸化時(shí)，可以激活CFTR。

圖1 CFTR氯離子通道的結(jié)構(gòu)模型[3]

2 CFTR的調(diào)節(jié)機(jī)制

CFTR是一種cAMP/PKA依賴的上皮氯離子通道。允許氯離子順電化學(xué)梯度跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。與其他ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不同的是CFTR允許氯離子雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，而不是定向轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)胞內(nèi)氯離子濃度升髙，激活cAMP依賴的蛋白激酶最終可使通道打開，胞外的氯離子濃度升高也可以促進(jìn)通道打開。MSD1和MSD2共同構(gòu)成了對(duì)氯離子具有選擇性的通道。MSD的部分氨基酸構(gòu)成了對(duì)氯離子的選擇性運(yùn)輸，如帶有正電荷的K95、 R134、 R334、 K335、 R347和R1030在物種間具有高度保守性，它們的突變會(huì)影響到通道對(duì)氯離子的通透性。CFTR氯離子通道的門控性主要通過(guò)兩個(gè)NBD來(lái)調(diào)節(jié)。NBD1和NBD2組成頭尾相對(duì)的二聚體，在接觸面上形成2個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)，其中一個(gè)是由NBD1的Walker A基序與NBD2的LSGGQ基序形成的(位點(diǎn)1)，另一個(gè)是由NBD2的Walker A基序與NBD1的LSGGQ基序形成的(位點(diǎn)2)。

CFTR氯離子通道開放的基本步驟是： R結(jié)構(gòu)域必須先由cAMP介導(dǎo)的PKA磷酸化；ATP與兩個(gè)NBD結(jié)合，改變CFTR立體構(gòu)象，NBD1和NBD2形成緊密結(jié)合的二聚體，使CFTR氯離子通道開放，氯離子外流；結(jié)合于NBD2的ATP水解，ATP的水解和水解產(chǎn)物Pi的喪失使相對(duì)穩(wěn)定的開路狀態(tài)變得不穩(wěn)定。隨后，緊密結(jié)合的二聚體界面被破壞，通道關(guān)閉。

R結(jié)構(gòu)域通過(guò)磷酸化和調(diào)節(jié)NBD對(duì)ATP的結(jié)合和水解能力，調(diào)控通道的門控。R結(jié)構(gòu)域含有大量可被磷酸化的位點(diǎn)(如絲氨酸、蘇氨酸等)，它們可以被PKA或PKC磷酸化，同時(shí)這些位點(diǎn)也受到磷酸酶的調(diào)節(jié)，從而實(shí)現(xiàn)可逆磷酸化調(diào)節(jié)。當(dāng)R結(jié)構(gòu)域中的絲氨酸被磷酸化后，可以有效地促進(jìn)兩個(gè)NBD結(jié)構(gòu)域的二聚體化，同時(shí)還增加了它們對(duì)ATP的結(jié)合和水解能力。CFTR氯離子通道的關(guān)閉則與R結(jié)構(gòu)域的去磷酸化相關(guān)。

3 CFTR與囊性纖維化

CFTR廣泛分布于多種組織器官，如肺、肝、胰腺、呼吸道、腸道、膽道、生殖道、心臟和血管平滑肌等。CFTR對(duì)電解質(zhì)和水分的分泌和吸收發(fā)揮著非常重要的作用。

CFTR基因突變是引起囊性纖維化(CF)臨床癥狀的分子基礎(chǔ)。目前已報(bào)道超過(guò)1900種基因突變。常見的類型有氨基酸刪除(ΔF508、ΔI507等)、氨基酸代換(錯(cuò)義突變)、翻譯提前終止(無(wú)義突變)、插入或刪除1到2個(gè)堿基而引起的移碼突變，此外還有內(nèi)含子堿基突變影響外顯子拼接而翻譯出缺陷的蛋白質(zhì)。上述突變最常見的是CFTR第508位苯丙氨酸缺失(ΔF508-CFTR)，引起蛋白質(zhì)異常折疊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的泛素連接酶復(fù)合體可以有效地識(shí)別ΔF508-CFTR，從而將其降解。因此ΔF508-CFTR無(wú)法到達(dá)細(xì)胞膜形成氯離子通道，即使少量到達(dá)細(xì)胞膜也無(wú)法有效打開通道，從而造成氯離子運(yùn)輸嚴(yán)重障礙。這種突變引起的后果最為嚴(yán)重，約占所有突變的70%，是CFTR基因突變的主要類型。多種與人類CF癥狀或發(fā)病機(jī)理類似的轉(zhuǎn)ΔF508-CFTR基因模型和ΔF508-CFTR基因敲除模型已成功建立(如豬、雪貂、小鼠和細(xì)胞系等)，以用作CF診斷、治療和藥物研發(fā)。

3.1 CF患者肺部感染及炎癥 呼吸道表面附有黏液纖毛清除系統(tǒng)，主要由纖毛細(xì)胞、黏液層、漿液層、杯狀細(xì)胞與漿液細(xì)胞組成，其中黏液層和漿液層合稱為呼吸道表面液體(ASL)。ASL是抵抗病原體侵入機(jī)體的第一道防線，當(dāng)有害因子吸入呼吸道時(shí)，黏附于黏液層，由上皮纖毛細(xì)胞的纖毛在漿液層中作周期性擺動(dòng)，將黏附于黏液層的有害因子和異物排出呼吸道。ASL中的抗菌肽、抗氧化因子、防御素和溶菌酶等免疫因子，不僅有抗菌、抗損傷作用，而且介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，是呼吸道免疫防御的重要環(huán)節(jié)。CF患者的一個(gè)典型特征就是呼吸道上覆黏稠、增厚的黏液，黏液不能被黏液纖毛清除系統(tǒng)清除，最終導(dǎo)致包括銅綠假單胞菌在內(nèi)的少數(shù)機(jī)會(huì)性細(xì)菌對(duì)氣道的定植和感染，同時(shí)機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗體，抗體和細(xì)菌結(jié)合后使大量的中性粒細(xì)胞聚集于病變部位，釋放大量的蛋白酶，引起免疫介導(dǎo)的病變部位的炎癥反應(yīng)，但失衡的免疫調(diào)節(jié)無(wú)法清除外在感染，反而通過(guò)多種機(jī)制進(jìn)一步損傷氣管結(jié)構(gòu)，最終發(fā)展為不可逆的支氣管擴(kuò)張。在呼吸道CFTR主要表達(dá)于呼吸道上皮細(xì)胞和黏膜下腺體細(xì)胞的頂膜側(cè)。呼吸道上皮的CFTR和上皮鈉通道(ENaC)可通過(guò)控制水、鹽跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)調(diào)節(jié)ASL的成分、厚度及黏液——纖毛擺動(dòng)的速率。生理情況下，CFTR氯離子通道激活后，氯離子與ATP排出到呼吸道管腔，ATP又可激活外向整流氯離子通道(ORCC)和鈣激活氯離子通道(CaCCs)，氯離子通過(guò)CFTR、 ORCC與CaCCs等離子通道流出細(xì)胞，并且為水分子的流出提供了滲透動(dòng)力。CF患者異常的CFTR不能正常分泌氯離子和ATP，上述氯離子通道受阻，氯離子在細(xì)胞內(nèi)積累。在CFTR缺陷的情況下，ENaC通道被上調(diào)，呼吸道上皮ENaC功能增強(qiáng)，通過(guò)ENaC吸收鈉離子增加，黏液中過(guò)多的鈉離子轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞，破壞了細(xì)胞的電解質(zhì)平衡，水分從黏液中轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞和血液中去，使黏液丟失水分而變得稠厚。

CFTR基因突變導(dǎo)致上皮氯離子分泌減少，鈉離子吸收增加。然而，這些改變的離子轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程與CF肺病之間的機(jī)制還不清楚。有關(guān)CF肺病的發(fā)病機(jī)制還有高鹽假說(shuō)： CF患者ASL中氯化鈉的濃度高于正常人，高濃度的氯化鈉使ASL中的抗菌物質(zhì)失活，從而損傷了呼吸道的自我防御體系[4]。必修1教材《分子與細(xì)胞》73頁(yè)提到的“1996年研究人員發(fā)現(xiàn)，肺部細(xì)胞外側(cè)Na﹢的聚積會(huì)使肺易受細(xì)菌傷害”與高鹽假說(shuō)一致。

3.2 CF患者汗液中氯化鈉濃度升高 正常情況下，汗腺分泌汗液后經(jīng)由導(dǎo)管排泄到皮膚表面，汗液中的部分離子(如氯離子、鈉離子)可由導(dǎo)管重吸收。人體汗液中氯化鈉的濃度是由汗腺分泌和導(dǎo)管重吸收氯離子、鈉離子的平衡決定的。汗腺主要通過(guò)兩條途徑分泌氯離子： 一種是CFTR，另一種是CaCCs。即使在沒有CFTR的情況下，氯離子也會(huì)通過(guò)CaCCs分泌到汗液中。在汗腺導(dǎo)管上，CFTR和ENaC位于導(dǎo)管細(xì)胞的頂膜，ENaC的主要功能是重吸收汗液中的鈉離子，而CFTR負(fù)責(zé)重吸收汗液中的氯離子。由于氯離子內(nèi)流所造成的電化學(xué)梯度，鈉離子被動(dòng)地通過(guò)ENaC吸收，這減少了水和鹽的損失[5]。在汗腺導(dǎo)管上，ENaC的活性依賴于CFTR，并隨CFTR活性的增加而增強(qiáng)。CFTR缺陷會(huì)導(dǎo)致ENaC無(wú)法被激活[6， 7]。CF患者，汗腺導(dǎo)管細(xì)胞上CFTR功能異常，ENaC也不能被激活。汗液中氯離子重吸收明顯減少，鈉離子不能經(jīng)ENaC內(nèi)流，汗液中氯離子、鈉離子濃度明顯升高。