410000湖南省人民醫(yī)院，湖南長沙

2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝(NAFLD)發(fā)病率逐年增高，NAFLD 在2型糖尿病患者中的發(fā)病率高達(dá)50%[1]。胰高血糖素樣肽1(GLP-1)是由人體腸道分泌的激素[2]，它能促進(jìn)胰島素釋放，調(diào)節(jié)血糖。目前研究認(rèn)為，GLP-1 能緩解NAFLD 肝脂肪性變[3]，但其機制目前仍然未完全闡明。脂代謝相關(guān)基因乙酰輔酶A 羧化酶(ACC-α)、脂肪酸合酶(FAS)均是脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶，能促進(jìn)脂肪的合成[4]。利拉魯肽是人工合成的GLP-1類似物[5]，本試驗觀察利拉魯肽對ACC-α、FASmRNA表達(dá)的影響。

資料與方法

選取健康雄性8周齡SD大鼠30只，體重200～224 g，喂養(yǎng)1周后隨機分為普食組10只，試驗組20只。高脂高糖飼料：配方：10%豬油、20%蔗糖、2%膽固醇、1%膽酸鈉、67%基礎(chǔ)飼料[6]，喂養(yǎng)4周末禁食12 h，一次性左下腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)35 mg/kg，誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型；72 h后測隨機血糖≥16.7 mmol/L 為造模成功。成模大鼠18只。

試驗分組：SD大鼠18只根據(jù)性別、體重，隨機分為高脂飲食組和利拉魯肽組各9只，均給予高脂飼料喂養(yǎng)4周。①利拉魯肽組給予高脂飲食+利拉魯肽0.6 mg/(kg·d)腹腔注射8周。②高脂組給予高脂飲食+等劑量生理鹽水腹腔注射8周。③基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)4周后，普食組給予普通飲食+等劑量生理鹽水腹腔注射連續(xù)給藥8周。12周后3%戊巴比妥鈉麻醉并處死小鼠。

肝臟脂肪變程度：取大鼠肝臟最大葉距邊緣4 mm 處肝組織制成病理切片，HE染色后光鏡觀察(IM140圖像系統(tǒng))。

RT-PCR檢測大鼠肝組織脂代謝相關(guān)基因ACC-α、FASmRNA 的表達(dá)：取肝組織80 g 勻漿，用TRzol 試劑提取總RNA后，紫外分光光度計測定其濃度，取l μg 總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。ACC-α、FAS 和內(nèi)參β-actin 的基因序列設(shè)計引物，選擇最適條件分別對靶基因和內(nèi)參基因β-肌動蛋白(β-actin)進(jìn)行PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物進(jìn)行2.5%瓊脂糖凝膠電泳，以靶基因與β-actin 電泳條帶密度比值計算各靶基因mRNA相對表達(dá)量。

統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0 軟件處理；計量資料以(±s)表示，采用t檢驗；均經(jīng)檢驗符合正態(tài)性，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較用LSD-t 檢驗；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

三組大鼠肝細(xì)胞病理比較：普食組肝細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞中央有大而圓的細(xì)胞核，無脂肪樣變。見圖1a。高脂飲食組肝細(xì)胞體積變大、腫脹，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不一的空泡，散布于整個胞漿內(nèi)。見圖1b。利拉魯肽組大鼠肝細(xì)胞較高脂飲食組細(xì)胞明顯縮小，部分可見小泡性脂肪變，并且脂漿內(nèi)空泡數(shù)量明顯減少。見圖1c。

三組大鼠肝臟組織FAS、ACC-amR NA相對表達(dá)量比較：與普食組比較，高脂飲食組與利拉魯肽組大鼠肝組織FAS、ACC-amRNA 相對表達(dá)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；利拉魯肽組FAS、ACC-amRNA相對表達(dá)量明顯低于高脂飲食組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1、圖2。

圖1 大鼠肝臟HE染色(×400)

表1 三組大鼠肝臟組織FAS、ACC-amRNA相對表達(dá)量比較(±s)

注：與普食組相比，aP＜0.05，與高脂組相比，aP＜0.05。

組別 n FAS ACC-a普食組 10 0.21±0.08 0.29±0.09高脂組 9 0.83±0.13a 1.14±0.06a利拉魯肽組 9 0.41±0.07ab 0.48±0.07ab F 88.34 92.41 P 0.001 0.001

圖2 三組大鼠肝臟組織FAS、ACC-amRNA表達(dá)比較

討 論

2型糖尿病合并NAFLD 的發(fā)病率逐年增高，目前2型糖尿病合并NAFLD 的發(fā)病機制仍未完全闡明。大家一致認(rèn)同NAFLD 與氧化應(yīng)激、胰島素抵抗、線粒體功能異常、異常的炎癥因子和脂質(zhì)過氧化等多種因素形成的“二次打擊”學(xué)說密切相關(guān)[7]。在此理論中，以胰島素抵抗、炎性反應(yīng)、脂質(zhì)過氧化及氧化應(yīng)激為核心的二次打擊最終導(dǎo)致脂肪性變的肝臟產(chǎn)生炎癥、壞死甚至纖維化。目前研究證實，脂肪組織能夠生成和分泌大量生長因子、細(xì)胞因子和活性肽等物質(zhì)[8]。脂代謝相關(guān)基因肝臟ACC-α、FAS 均是脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶，能促進(jìn)脂肪合成。本研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠予高脂飲食后脂代謝相關(guān)基因ACC-α、FAS表達(dá)增加，提示在2型糖尿病中脂代謝相關(guān)基因表達(dá)增加，從而促進(jìn)脂肪肝形成。

目前對2型糖尿病合并脂肪肝尚無明確有效的治療方法[9]，有效治療脂肪肝的藥物是臨床需要。利拉魯肽是GLP-1類似物，具有控制血糖、改善胰島素抵抗的作用。目前動物和人體試驗發(fā)現(xiàn)，GLP-1 對2型糖尿病合并脂肪肝有一定作用，但具體機制未明。從本動物研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽確實能改善2型糖尿病合并脂肪肝小鼠的肝臟脂肪性變。利拉魯肽能降低肝臟脂代謝相關(guān)基因ACCα、FAS表達(dá)，提示利拉魯肽可通過調(diào)節(jié)脂肪代謝，來緩解2型糖尿病肝臟脂肪性變，有效減少2型糖尿病患者脂肪肝發(fā)生率。

本研究通過動物試驗驗證了GLP-1類似物利拉魯肽能改善2型糖尿病合并脂肪肝患者肝臟脂肪性變程度。探討利拉魯肽改善肝脂肪性變機制，可為科學(xué)合理地指導(dǎo)臨床中糖尿病合并脂肪肝治療提供合理的理論依據(jù)。