李曉軍，馬躍英，郭躍東，王海霞，馮 謙，王春穎，李康寧，黃少磊，劉彥民

（內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010）

乳酸菌是工業(yè)上公認(rèn)的發(fā)酵能力最強(qiáng)的微生物，主要用于益生菌和乳酸生產(chǎn)。盡管如此，乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中通常受到產(chǎn)物乳酸的抑制，導(dǎo)致生長(zhǎng)速度減緩或停止，從而不能達(dá)到理想的細(xì)胞濃度或者乳酸濃度。目前，常用的濃縮培養(yǎng)方法主要有緩沖鹽法、化學(xué)中和法、透析培養(yǎng)法、膜過(guò)濾法和微膠囊培養(yǎng)法等。從成本和應(yīng)用規(guī)模上考慮，只有緩沖鹽法和化學(xué)中和法更適合大規(guī)模的生產(chǎn)。一般情況下，研究人員以緩沖鹽法配合化學(xué)中和法來(lái)實(shí)現(xiàn)更高的菌體密度。常用的中和劑有碳酸鈣、氫氧化鈣、氨水、氫氧化鈉或氫氧化鉀[1]。我國(guó)工業(yè)上常用碳酸鈣作為乳酸發(fā)酵的中和劑。目前，針對(duì)不同類型的酸中和劑對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸影響的研究比較多[2]。但是，關(guān)于不同目數(shù)碳酸鈣對(duì)乳酸菌發(fā)酵和凍干的影響的研究非常鮮見(jiàn)。以保加利亞乳桿菌為研究對(duì)象，系統(tǒng)比較了不同目數(shù)碳酸鈣對(duì)保加利亞乳桿菌發(fā)酵和凍干的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

保加利亞乳桿菌NQ2508。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉 5 g，吐溫 -80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，碳酸鈣2 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值6.6。MRS檢測(cè)培養(yǎng)基：在以上改良MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入15 g的瓊脂粉。凍干保護(hù)劑配方：脫脂乳200 g，乳糖120，谷氨酸鈉10 g，抗壞血酸10 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 主要試劑

乳酸為分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司提供；100目，200目，325目，600目，800目和1 250目輕質(zhì)碳酸鈣，天津燕東礦產(chǎn)品有限公司提供。

1.1.4 主要儀器及設(shè)備

J2-21型離心機(jī)（BECKMAN）、超凈臺(tái)BCN-1360，哈爾濱東聯(lián)公司產(chǎn)品；1029型厭氧培養(yǎng)箱，F(xiàn)orma scientific公司產(chǎn)品；2014-025Bb型真空冷凍干燥機(jī)，上海東富龍公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 不同目數(shù)碳酸鈣中和乳酸能力比較

配制含不同目數(shù)碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基各200 mL，于121℃下滅菌15 min。冷卻至室溫后，分別以50%的乳酸滴定，每次每組加入的量均為50μL，加入后搖瓶5 s，然后測(cè)定pH值，直到所有組的pH值均降到4.5以下，停止滴加。比較各培養(yǎng)基pH值降到4.5時(shí)滴加乳酸的量。根據(jù)乳酸的滴加量來(lái)初步比較各種碳酸鈣中和乳酸的能力。

1.2.2 不同目數(shù)碳酸鈣對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)影響

將保加利亞乳桿菌菌種在MRS液體培養(yǎng)基中活化2代后，按5%的接種量分別接種于含不同目數(shù)碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)箱于37℃下培養(yǎng)。每隔1 h取樣測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù)和pH值，以活菌數(shù)和pH值為縱坐標(biāo)、時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。比較不同目數(shù)碳酸鈣對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的影響。

1.2.3 不同目數(shù)碳酸鈣對(duì)保加利亞乳桿菌凍干影響

將保加利亞乳桿菌菌種在MRS液體培養(yǎng)基中活化2代后，按5%的接種量分別接種于含不同目數(shù)碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期時(shí)，于4℃下各發(fā)酵液以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心20 min，棄去上清，離心得到的菌體以2倍質(zhì)量的保護(hù)劑懸浮，然后進(jìn)行真空冷凍干燥（預(yù)凍：-40℃，2 h；升華干燥：-30～-8℃，8 h；解析干燥：8～25℃，4 h）。得到的凍干粉進(jìn)行活菌數(shù)檢測(cè)，并計(jì)算凍干存活率。凍干存活率的計(jì)算方法為：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同目數(shù)碳酸鈣中和乳酸能力比較

含不同目數(shù)碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基滅菌后的pH值基本一致，都在6.5左右。但每種培養(yǎng)基中和乳酸的能力卻有很大差別。同樣將培養(yǎng)基pH值降到4.5，325目的碳酸鈣所消耗的乳酸最多，為1 450μL。初步可以判斷325目碳酸鈣的中和能力較其他幾種要強(qiáng)。

不同目數(shù)碳酸鈣中和乳酸的能力比較見(jiàn)圖1。

圖1 不同目數(shù)碳酸鈣中和乳酸的能力比較

2.2 不同目數(shù)碳酸鈣對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的影響

各試驗(yàn)組的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 各試驗(yàn)組的生長(zhǎng)曲線

由圖2可知，各試驗(yàn)組接種后經(jīng)過(guò)短的緩慢期（約2 h）后，進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在發(fā)酵到6～8 h，時(shí)，菌體從對(duì)數(shù)期進(jìn)入穩(wěn)定期?？梢?jiàn)，使用325目的碳酸鈣的試驗(yàn)組3在8 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，比其余各組晚2 h，對(duì)數(shù)期時(shí)間的延長(zhǎng)，也使得發(fā)酵液活菌數(shù)得到了很大的提升。其中，試驗(yàn)組3的發(fā)酵液活菌數(shù)最高，達(dá)到19×108CFU/mL，與其他組相比，有顯著性差異 （F=21.90，p＜0.01）。

2.3 不同目數(shù)碳酸鈣對(duì)保加利亞乳桿菌凍干的影響

在對(duì)數(shù)末期和穩(wěn)定性前期收獲各組發(fā)酵液，加入凍干保護(hù)劑，進(jìn)行冷凍干燥，并計(jì)算凍干存活率。由表1和圖3的結(jié)果可以看出，試驗(yàn)組3的凍干存活率較高，與其他組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。

3 結(jié)論

碳酸鈣的目數(shù)越高，粒徑越小。粒徑的大小決定了碳酸鈣顆粒的比表面積及顆粒上孔的大小和數(shù)量。在碳酸鈣顆粒上的孔可以為乳酸菌提供一個(gè)相對(duì)有利的微環(huán)境[3]。首先，碳酸鈣外殼可以使孔內(nèi)細(xì)胞保持較高的活性水平，保護(hù)細(xì)胞不受研磨力和剪切力的影響。其次，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸一旦被釋放到細(xì)胞外溶液中，這部分乳酸就會(huì)被其周圍的碳酸鈣快速消耗，從而導(dǎo)致細(xì)胞周圍溶液中游離乳酸濃度的降低。從而降低游離乳酸的反饋抑制作用，提高細(xì)胞微環(huán)境的pH值[4]。研究得到的結(jié)果顯示，使用325目碳酸鈣的試驗(yàn)組3的發(fā)酵液活菌數(shù)和凍干存活率最高，其次是使用800目碳酸鈣的試驗(yàn)組5。目數(shù)太大和太小的試驗(yàn)組發(fā)酵液活菌數(shù)和凍干存活率均不高?？赡艿脑蚴?，小目數(shù)的碳酸鈣質(zhì)量大、易沉底，大目數(shù)的碳酸鈣質(zhì)量小易漂浮，只有325目的碳酸鈣處于懸浮狀態(tài)，與乳酸菌的接觸面積最大，且其比表面積和孔的大小及數(shù)量也適宜。

表1 各試驗(yàn)組的凍干存活率（±s）

表1 各試驗(yàn)組的凍干存活率（±s）

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圖3 各試驗(yàn)組的凍干存活率

研究的不足之處在于，沒(méi)有從微觀角度證實(shí)不同目數(shù)碳酸鈣形貌之間的區(qū)別，及保加利亞乳桿菌與碳酸鈣顆粒之間的相互作用的機(jī)理。但是，研究的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值還是非常大的。首先，為乳酸菌發(fā)酵中和劑的篩選又創(chuàng)造了一條新途徑和一種新的思路。其次，研究結(jié)果可進(jìn)一步通過(guò)中試試驗(yàn)和生產(chǎn)試驗(yàn)的驗(yàn)證，應(yīng)用于生產(chǎn)中，提升產(chǎn)能。