張雨豪，喬江濤，張紅城

（中國農業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京 100081）

隨著生活水平的日益提高，人們在日常飲食中攝入的碳水化合物和脂類的總量有了顯著增加，伴隨內分泌失調，很多人正面臨著由于體內脂質代謝紊亂而導致的一系列代謝問題[1-3]。與脂代謝紊亂密切相關的各種心血管疾病[4]、糖尿病[5]等正在嚴重地威脅人類的健康。因而，從天然產物中探索尋找能夠調控脂代謝紊亂的有效成分，并深入研究揭示其在調控脂代謝紊亂方面的作用機制，正被越來越多的科研工作者所關注。蜂膠中含有種類繁多且含量豐富的多酚類化合物，有研究試驗表明，植物來源的多酚類物質，如金雀異黃素[6]、柚皮素[7]等，對改善脂代謝紊亂具有積極作用。蜂膠作為一種傳統(tǒng)藥物，在很早以前就有將其應用于輔助治療代謝疾病的相關報道。近年來，隨著國內外科研工作者對蜂膠研究的不斷深入，越來越多的研究正集中在探索揭示其在調控脂質代謝紊亂方面的作用機制[8-12]。在這些研究當中，蜂膠中含有的多酚類化合物往往被作為主要的研究對象。

蜂膠具有很多種類，如我國蜂膠的代表性類型是楊樹型蜂膠，而產自巴西的綠蜂膠則主要以酒神菊類為膠原植物。蜂膠中的多酚類物質主要包括黃酮類化合物和酚酸類化合物，且不同產地、不同品種蜂膠中含有的多酚類物質組成具有很大的差異性[13-14]。此外，以往有關蜂膠能夠調控和改善脂質代謝的研究多集中于黃酮類化合物，而關于酚酸類化合物的功能評價則相對較少，這是因為相比黃酮類化合物，酚酸類化合物的提取和制備有一定困難，且成本更高。因此，為了更加全面地了解蜂膠中對調節(jié)脂代謝紊亂能夠起到改善作用的有效成分，試驗以中國蜂膠作為研究對象，對中國蜂膠中存在的主要幾種酚酸類成分進行了調節(jié)脂質代謝功能評價，通過建立細胞模型篩選出具有較好的降低細胞內脂質累積效果的酚酸類化合物成分。以期為中國蜂膠中有效成分在脂質代謝紊亂引發(fā)疾病的藥物開發(fā)及應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L02正常肝細胞，中國科學院細胞庫提供；咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、肉桂酸、亞桂皮乙酸、油紅O染料、噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、棕櫚酸鈉（PA），美國Sigma公司提供；胎牛血清（FBS）、青鏈霉素 （10 000 U/L）、非必需氨基酸（NEAA，100×）、0.25%胰蛋白酶，美國Gibico公司提供；牛血清白蛋白（BSA，無脂肪酸），德國Merck公司提供；乙醇（分析純）、異丙醇（分析純），北京化學試劑公司提供；蘇木精染料、4%的多聚甲醛，北京酷來搏科技有限公司提供；DEME高糖培養(yǎng)基，美國Hyclone公司提供；超純水純化系統(tǒng)Milli Q Intergral，美國Merk Millipore公司提供。

1.2 儀器與設備

96孔細胞培養(yǎng)板、10 cm細胞培養(yǎng)皿、細胞凍存管，美國Corning公司產品；0.22μm微孔過濾膜，德國Merck Millipore公司產品；分析天平，梅特勒-托利儀器有限公司產品；HERA cell 150 CO2型恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司產品；Olympus IX71型倒置熒光顯微成像系統(tǒng)，日本Olympus公司產品；酶標儀，美國Biotek公司產品；AIRTECH無菌操作臺，北京市華威中儀科技有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

細胞培養(yǎng)標準化學品溶液：準確稱取咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、肉桂酸和亞桂皮乙酸的標準品，于DMSO中進行溶解，并配成濃度為200μmol/L的儲備液，各儲備液經0.22μm的濾膜過濾后，于-20℃條件下儲存?zhèn)溆?，使用前可按要求濃度進行稀釋。

1.3.2 細胞的培養(yǎng)

L02細胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、100μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中。細胞均置于溫度37℃，CO25%，濕度95%的培養(yǎng)箱中，每2 d用胰酶消化傳代1次。

1.3.3 MTT試驗法檢測酚酸對細胞活力影響

MTT試驗參照Mosmann文獻方法[15]。即在96孔板中，按每孔104個細胞的密度接種處于對數(shù)生長期細胞，培養(yǎng)體積為100μL/孔。接種24 h后，向孔中加入梯度濃度的藥物儲備液進行培養(yǎng)，DMSO濃度保持為0.1%，空白組為只含0.1%的DMSO，每個濃度做3個復孔。24 h后，棄去培養(yǎng)基上清液，用PBS清洗干凈后向其中加入含有MTT（0.5 mg/L）的DMEM完全培養(yǎng)基（含10%FBS），放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后，棄去培養(yǎng)基上清液，向其中加入150μL DMSO溶液以溶解多聚甲醛，將96孔板置于搖床上反應10 min，然后于波長490 nm處讀取每孔吸光度。存活率即每個濃度的吸光度與空白組的吸光度占比。

1.3.4 細胞脂質累積模型的建立

細胞脂質累積模型參照Xie C等人[16]文獻方法構建，稍作調整。簡單來說，在12孔板中，按每孔5×105個細胞的密度在爬片上進行細胞培養(yǎng)，試驗組棕櫚酸鈉 （PA） 濃度分別為 100，200，300，400，500μmol/L，空白對照組為只含BSA，共設6個組，每組2個復孔，共同培養(yǎng)24 h后紅油染色。方法為培養(yǎng)后迅速吸去12孔板中的培養(yǎng)基上清液，用PBS清洗干凈后，向每孔中加入質量分數(shù)4%的多聚甲醛溶液400μL于室溫下固定。15 min后將固定液棄掉，用二次水清洗干凈后，向每孔中加入500μL的60%紅油O染色液并輕輕搖晃，以使染色液鋪染均勻，然后將12孔板于4℃條件下染色10 min，期間需避光。染色完成棄掉染色液，用二次水清洗干凈后，向每孔中加入蘇木精染色液進行染色，保持30 s后棄去，用二次水清洗1 min。最后，將爬片從12孔板中取出，用甘油和載玻片封片，在顯微鏡下進行觀察。每個玻片需選取10個視野，通過Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計細胞被油紅O染色的面積（Sum），用Photoshop軟件統(tǒng)計細胞總生長面積（Area），二者數(shù)值之比即可反映細胞脂質累積的程度。數(shù)據結果以空白對照進行歸一化處理。

1.3.5 酚酸對L02細胞脂質累積的作用

在12孔板中，按每孔5×105個細胞的密度在爬片上進行細胞培養(yǎng)，PA處理的模型組（相同濃度BSA+PA+0.1%DMSO），PA與非諾貝特酸處理的陽性對照組（相同濃度BSA+PA+0.1%DMSO+100μmol/L非諾貝特酸），PA分別與5，20，50，100μmol/L 4個濃度的藥物處理組（相同濃度BSA+PA+0.1%DMSO+不同濃度的藥物儲備液），只含BSA的空白對照組（相同濃度BSA+0.1%DMSO），共設置7個組，每組2個復孔。藥物處理組培養(yǎng)24h后紅油染色，數(shù)據結果以空白對照進行歸一化處理，分析比較5種酚酸類物質的降脂作用差異。

1.3.6 統(tǒng)計學分析

通過SPSS 19軟件對獲得的結果數(shù)據進行統(tǒng)計學分析，采用t檢驗進行顯著性評價，當p＜0.05即認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 酚酸對L02細胞活力的影響

不同濃度的咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、肉桂酸、亞桂皮乙酸和棕櫚酸對L02細胞活力的影響見圖1。

采用MTT法評價了蜂膠中咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、肉桂酸、亞桂皮乙酸5種酚酸類物質對L02人肝細胞細胞活力的影響。由圖1可知，5種酚酸類物質在選擇的濃度梯度范圍內對L02人肝細胞皆不具有明顯毒性，甚至咖啡酸在一定濃度范圍還能夠促進L02人肝細胞的增殖。相較而言，只有阿魏酸濃度在200μmol/L時，其與空白組相比，細胞存活率的降低具有顯著性，但細胞存活率仍在85%以上。

圖1 不同濃度的咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、肉桂酸、亞桂皮乙酸和棕櫚酸對L02細胞活力的影響

2.2 PA誘導L02細胞產生胞內脂質累積

PA處理24 h后L02人肝細胞細胞內脂質累積情況見圖2。

圖2 PA處理24 h后L02人肝細胞細胞內脂質累積情況

采用MTT法評價了棕櫚酸（PA） 對L02人肝細胞細胞活力的影響。由圖2可知，當PA濃度高于100μmol/L時，將會對L02人肝細胞細胞活力產生顯著性影響；當PA濃度高于300μmol/L時，L02人肝細胞的存活率低于70%；當PA濃度為500μmol/L時，L02人肝細胞的存活率僅為54%。此外，通過顯微鏡對細胞進行觀察，可觀察到已有一定數(shù)量的細胞呈漂浮狀態(tài)。因此，研究選擇的PA作用濃度為不高于500μmol/L。

PA能夠誘導L02人肝細胞內脂滴的形成，并且形成脂滴的單位面積會隨著PA作用濃度的增加而呈現(xiàn)增大趨勢。當PA作用濃度大于300μmol/L時，細胞生長面積開始減小，這與MTT試驗中細胞存活率的變化趨勢相一致。此外，已有研究表明[17]，當PA作用濃度達到300μmol/L時，即可影響細胞內多個通路蛋白的正常表達，并引發(fā)細胞發(fā)生脂質代謝異常。因此，試驗選擇300μmol/L作為PA的作用濃度，用于接下來的L02人肝細胞相關研究。

2.3 蜂膠中酚酸對L02細胞脂質累積的影響

PA和不同濃度異阿魏酸（IFRA） 處理24 h后L02人肝細胞細胞內脂質累積情況見圖3。

圖3 PA和不同濃度異阿魏酸（IFRA）處理24 h后L02人肝細胞細胞內脂質累積情況

通過對模型組、陽性對照組、空白組及不同濃度的藥物處理組的紅油O染色，以及對細胞內脂滴面積進行統(tǒng)計分析，結果顯示PA（300μmol/L） 作用24 h后，細胞內脂質累積程度可達空白對照組的1.5～3.0倍，對于藥物處理組，試驗選擇的5種酚酸類物質中異阿魏酸的降低細胞內脂質累積的效果最好，相較于陽性對照組使用的非諾貝特酸，異阿魏酸在濃度同為100μmol/L時，可將脂質累積降低約22%，同濃度的非諾貝特酸的平均脂質累積減少約為30%。同時，研究結果還表明，另外4種酚酸類物質咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸和亞桂皮乙酸并沒有令人滿意的改善細胞內脂質累積的效果。

3 結論

以中國蜂膠作為研究對象，對中國蜂膠中含量最多的5種酚酸類成分包括咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、肉桂酸和亞桂皮乙酸進行調節(jié)脂質代謝效果評價。通過建立L02人肝細胞脂質累積模型，評價篩選出了這5種酚酸類成分中具有較好降低脂質累積效果的有效成分異阿魏酸，并通過試驗研究確定其最佳的作用濃度為100μmol/L。