張雨豪，喬江濤，張紅城

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100081）

隨著生活水平的日益提高，人們在日常飲食中攝入的碳水化合物和脂類的總量有了顯著增加，伴隨內(nèi)分泌失調(diào)，很多人正面臨著由于體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂而導(dǎo)致的一系列代謝問題[1-3]。與脂代謝紊亂密切相關(guān)的各種心血管疾病[4]、糖尿病[5]等正在嚴(yán)重地威脅人類的健康。因而，從天然產(chǎn)物中探索尋找能夠調(diào)控脂代謝紊亂的有效成分，并深入研究揭示其在調(diào)控脂代謝紊亂方面的作用機(jī)制，正被越來越多的科研工作者所關(guān)注。蜂膠中含有種類繁多且含量豐富的多酚類化合物，有研究試驗表明，植物來源的多酚類物質(zhì)，如金雀異黃素[6]、柚皮素[7]等，對改善脂代謝紊亂具有積極作用。蜂膠作為一種傳統(tǒng)藥物，在很早以前就有將其應(yīng)用于輔助治療代謝疾病的相關(guān)報道。近年來，隨著國內(nèi)外科研工作者對蜂膠研究的不斷深入，越來越多的研究正集中在探索揭示其在調(diào)控脂質(zhì)代謝紊亂方面的作用機(jī)制[8-12]。在這些研究當(dāng)中，蜂膠中含有的多酚類化合物往往被作為主要的研究對象。

蜂膠具有很多種類，如我國蜂膠的代表性類型是楊樹型蜂膠，而產(chǎn)自巴西的綠蜂膠則主要以酒神菊類為膠原植物。蜂膠中的多酚類物質(zhì)主要包括黃酮類化合物和酚酸類化合物，且不同產(chǎn)地、不同品種蜂膠中含有的多酚類物質(zhì)組成具有很大的差異性[13-14]。此外，以往有關(guān)蜂膠能夠調(diào)控和改善脂質(zhì)代謝的研究多集中于黃酮類化合物，而關(guān)于酚酸類化合物的功能評價則相對較少，這是因為相比黃酮類化合物，酚酸類化合物的提取和制備有一定困難，且成本更高。因此，為了更加全面地了解蜂膠中對調(diào)節(jié)脂代謝紊亂能夠起到改善作用的有效成分，試驗以中國蜂膠作為研究對象，對中國蜂膠中存在的主要幾種酚酸類成分進(jìn)行了調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝功能評價，通過建立細(xì)胞模型篩選出具有較好的降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積效果的酚酸類化合物成分。以期為中國蜂膠中有效成分在脂質(zhì)代謝紊亂引發(fā)疾病的藥物開發(fā)及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L02正常肝細(xì)胞，中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供；咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、肉桂酸、亞桂皮乙酸、油紅O染料、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、棕櫚酸鈉（PA），美國Sigma公司提供；胎牛血清（FBS）、青鏈霉素 （10 000 U/L）、非必需氨基酸（NEAA，100×）、0.25%胰蛋白酶，美國Gibico公司提供；牛血清白蛋白（BSA，無脂肪酸），德國Merck公司提供；乙醇（分析純）、異丙醇（分析純），北京化學(xué)試劑公司提供；蘇木精染料、4%的多聚甲醛，北京酷來搏科技有限公司提供；DEME高糖培養(yǎng)基，美國Hyclone公司提供；超純水純化系統(tǒng)Milli Q Intergral，美國Merk Millipore公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞凍存管，美國Corning公司產(chǎn)品；0.22μm微孔過濾膜，德國Merck Millipore公司產(chǎn)品；分析天平，梅特勒-托利儀器有限公司產(chǎn)品；HERA cell 150 CO2型恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；Olympus IX71型倒置熒光顯微成像系統(tǒng)，日本Olympus公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，美國Biotek公司產(chǎn)品；AIRTECH無菌操作臺，北京市華威中儀科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)品溶液：準(zhǔn)確稱取咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、肉桂酸和亞桂皮乙酸的標(biāo)準(zhǔn)品，于DMSO中進(jìn)行溶解，并配成濃度為200μmol/L的儲備液，各儲備液經(jīng)0.22μm的濾膜過濾后，于-20℃條件下儲存?zhèn)溆?，使用前可按要求濃度進(jìn)行稀釋。

1.3.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

L02細(xì)胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、100μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中。細(xì)胞均置于溫度37℃，CO25%，濕度95%的培養(yǎng)箱中，每2 d用胰酶消化傳代1次。

1.3.3 MTT試驗法檢測酚酸對細(xì)胞活力影響

MTT試驗參照Mosmann文獻(xiàn)方法[15]。即在96孔板中，按每孔104個細(xì)胞的密度接種處于對數(shù)生長期細(xì)胞，培養(yǎng)體積為100μL/孔。接種24 h后，向孔中加入梯度濃度的藥物儲備液進(jìn)行培養(yǎng)，DMSO濃度保持為0.1%，空白組為只含0.1%的DMSO，每個濃度做3個復(fù)孔。24 h后，棄去培養(yǎng)基上清液，用PBS清洗干凈后向其中加入含有MTT（0.5 mg/L）的DMEM完全培養(yǎng)基（含10%FBS），放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后，棄去培養(yǎng)基上清液，向其中加入150μL DMSO溶液以溶解多聚甲醛，將96孔板置于搖床上反應(yīng)10 min，然后于波長490 nm處讀取每孔吸光度。存活率即每個濃度的吸光度與空白組的吸光度占比。

1.3.4 細(xì)胞脂質(zhì)累積模型的建立

細(xì)胞脂質(zhì)累積模型參照Xie C等人[16]文獻(xiàn)方法構(gòu)建，稍作調(diào)整。簡單來說，在12孔板中，按每孔5×105個細(xì)胞的密度在爬片上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，試驗組棕櫚酸鈉 （PA） 濃度分別為 100，200，300，400，500μmol/L，空白對照組為只含BSA，共設(shè)6個組，每組2個復(fù)孔，共同培養(yǎng)24 h后紅油染色。方法為培養(yǎng)后迅速吸去12孔板中的培養(yǎng)基上清液，用PBS清洗干凈后，向每孔中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛溶液400μL于室溫下固定。15 min后將固定液棄掉，用二次水清洗干凈后，向每孔中加入500μL的60%紅油O染色液并輕輕搖晃，以使染色液鋪染均勻，然后將12孔板于4℃條件下染色10 min，期間需避光。染色完成棄掉染色液，用二次水清洗干凈后，向每孔中加入蘇木精染色液進(jìn)行染色，保持30 s后棄去，用二次水清洗1 min。最后，將爬片從12孔板中取出，用甘油和載玻片封片，在顯微鏡下進(jìn)行觀察。每個玻片需選取10個視野，通過Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計細(xì)胞被油紅O染色的面積（Sum），用Photoshop軟件統(tǒng)計細(xì)胞總生長面積（Area），二者數(shù)值之比即可反映細(xì)胞脂質(zhì)累積的程度。數(shù)據(jù)結(jié)果以空白對照進(jìn)行歸一化處理。

1.3.5 酚酸對L02細(xì)胞脂質(zhì)累積的作用

在12孔板中，按每孔5×105個細(xì)胞的密度在爬片上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，PA處理的模型組（相同濃度BSA+PA+0.1%DMSO），PA與非諾貝特酸處理的陽性對照組（相同濃度BSA+PA+0.1%DMSO+100μmol/L非諾貝特酸），PA分別與5，20，50，100μmol/L 4個濃度的藥物處理組（相同濃度BSA+PA+0.1%DMSO+不同濃度的藥物儲備液），只含BSA的空白對照組（相同濃度BSA+0.1%DMSO），共設(shè)置7個組，每組2個復(fù)孔。藥物處理組培養(yǎng)24h后紅油染色，數(shù)據(jù)結(jié)果以空白對照進(jìn)行歸一化處理，分析比較5種酚酸類物質(zhì)的降脂作用差異。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)分析

通過SPSS 19軟件對獲得的結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用t檢驗進(jìn)行顯著性評價，當(dāng)p＜0.05即認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚酸對L02細(xì)胞活力的影響

不同濃度的咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、肉桂酸、亞桂皮乙酸和棕櫚酸對L02細(xì)胞活力的影響見圖1。

采用MTT法評價了蜂膠中咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、肉桂酸、亞桂皮乙酸5種酚酸類物質(zhì)對L02人肝細(xì)胞細(xì)胞活力的影響。由圖1可知，5種酚酸類物質(zhì)在選擇的濃度梯度范圍內(nèi)對L02人肝細(xì)胞皆不具有明顯毒性，甚至咖啡酸在一定濃度范圍還能夠促進(jìn)L02人肝細(xì)胞的增殖。相較而言，只有阿魏酸濃度在200μmol/L時，其與空白組相比，細(xì)胞存活率的降低具有顯著性，但細(xì)胞存活率仍在85%以上。

圖1 不同濃度的咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、肉桂酸、亞桂皮乙酸和棕櫚酸對L02細(xì)胞活力的影響

2.2 PA誘導(dǎo)L02細(xì)胞產(chǎn)生胞內(nèi)脂質(zhì)累積

PA處理24 h后L02人肝細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積情況見圖2。

圖2 PA處理24 h后L02人肝細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積情況

采用MTT法評價了棕櫚酸（PA） 對L02人肝細(xì)胞細(xì)胞活力的影響。由圖2可知，當(dāng)PA濃度高于100μmol/L時，將會對L02人肝細(xì)胞細(xì)胞活力產(chǎn)生顯著性影響；當(dāng)PA濃度高于300μmol/L時，L02人肝細(xì)胞的存活率低于70%；當(dāng)PA濃度為500μmol/L時，L02人肝細(xì)胞的存活率僅為54%。此外，通過顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行觀察，可觀察到已有一定數(shù)量的細(xì)胞呈漂浮狀態(tài)。因此，研究選擇的PA作用濃度為不高于500μmol/L。

PA能夠誘導(dǎo)L02人肝細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成，并且形成脂滴的單位面積會隨著PA作用濃度的增加而呈現(xiàn)增大趨勢。當(dāng)PA作用濃度大于300μmol/L時，細(xì)胞生長面積開始減小，這與MTT試驗中細(xì)胞存活率的變化趨勢相一致。此外，已有研究表明[17]，當(dāng)PA作用濃度達(dá)到300μmol/L時，即可影響細(xì)胞內(nèi)多個通路蛋白的正常表達(dá)，并引發(fā)細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)代謝異常。因此，試驗選擇300μmol/L作為PA的作用濃度，用于接下來的L02人肝細(xì)胞相關(guān)研究。

2.3 蜂膠中酚酸對L02細(xì)胞脂質(zhì)累積的影響

PA和不同濃度異阿魏酸（IFRA） 處理24 h后L02人肝細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積情況見圖3。

圖3 PA和不同濃度異阿魏酸（IFRA）處理24 h后L02人肝細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積情況

通過對模型組、陽性對照組、空白組及不同濃度的藥物處理組的紅油O染色，以及對細(xì)胞內(nèi)脂滴面積進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示PA（300μmol/L） 作用24 h后，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積程度可達(dá)空白對照組的1.5～3.0倍，對于藥物處理組，試驗選擇的5種酚酸類物質(zhì)中異阿魏酸的降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積的效果最好，相較于陽性對照組使用的非諾貝特酸，異阿魏酸在濃度同為100μmol/L時，可將脂質(zhì)累積降低約22%，同濃度的非諾貝特酸的平均脂質(zhì)累積減少約為30%。同時，研究結(jié)果還表明，另外4種酚酸類物質(zhì)咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸和亞桂皮乙酸并沒有令人滿意的改善細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積的效果。

3 結(jié)論

以中國蜂膠作為研究對象，對中國蜂膠中含量最多的5種酚酸類成分包括咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、肉桂酸和亞桂皮乙酸進(jìn)行調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝效果評價。通過建立L02人肝細(xì)胞脂質(zhì)累積模型，評價篩選出了這5種酚酸類成分中具有較好降低脂質(zhì)累積效果的有效成分異阿魏酸，并通過試驗研究確定其最佳的作用濃度為100μmol/L。