張志堅 楊兆麗 張加頌 劉 澎 謝丹娥 王 琪

青蒿素哌喹片為青蒿素和哌喹組成的復(fù)方制劑，2006 年拿到國家一類新藥證書，具有自主知識產(chǎn)權(quán)，是廣東新南方青蒿藥業(yè)有限公司獨家生產(chǎn)品種。該藥主要用于治療惡性瘧、間日瘧和三日瘧，在國外尼日利亞、肯尼亞、坦桑尼亞等20 多個國家獲得注冊批件和專利，青蒿素哌喹片原標準為YBH08022006[1]，現(xiàn)行標準為中國藥典2015 年版二部“青蒿素哌喹片”項下標準[2]，采用高效液相色譜（HPLC）法檢查有關(guān)物質(zhì)，但該法檢測靈敏度低，0.05%自身對照溶液幾乎不能檢出，檢測波長選用216nm 不合適，檢測結(jié)果準確度低，且檢測結(jié)果偏高，與實際情況不符。為嚴格控制藥品質(zhì)量，我單位決定優(yōu)化質(zhì)量標準，提高制劑中哌喹有關(guān)物質(zhì)的靈敏度、專屬性和可靠性，本文參考2015 版中國藥典中“磷酸哌喹”[3]及其他文獻[3-8]中有關(guān)哌喹、磷酸哌喹類有關(guān)物質(zhì)的測定方法，研究HPLC 法測定青蒿素哌喹片中哌喹有關(guān)物質(zhì)的方法，并建立哌喹有關(guān)物質(zhì)限度[2-9]。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器 安捷倫1100 高效液相色譜儀；賽默飛Ultimate3000 高效液相色譜儀；色譜柱：Thermo BDS HYPERSIL C18 柱（250mm×4.6mm，5μm）、YMC-Triart C18 柱（250mm×4.6mm，5μm）；XP204S 型分析天平（梅特勒-托利多有限公司）（1/萬）；XS205DV 型分析天平（梅特勒-托利多有限公司）（1/10 萬）；FE20 型PH 計（梅特勒-托利多有限公司）。

1.2 試 藥 青蒿素哌喹片，廣東新南方青蒿藥業(yè)有限公司，批號20141001、20141002、20 141003；哌喹，廣東新南方青蒿藥業(yè)有限公司，批號20 161030；青蒿素，廣東新南方青蒿藥業(yè)有限公司，批號Y13 120001；雜質(zhì)I[7-氯-4-（1-哌嗪基）喹啉]，中國藥品檢定研究院，批號101339- 201501；雜質(zhì)II（7-氯-4-羥基喹啉），中國藥品檢定研究院，批號101340- 201501；雜質(zhì)Ⅲ[1，4-二（7-氯喹啉-4-基）哌嗪]，中國藥品檢定研究院，批號101341- 201501；甲醇、乙腈均為色譜級（上海安譜）；水為超純水；三氯乙酸（分析純，國藥集團）；三乙胺（分析純，國藥集團）；磷酸（分析純，國藥集團）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 色譜條件：色譜柱為Thermo BDS HYPERSIL C18 柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈-0.1%三氯乙酸溶液-三乙胺（18:82:0.2，磷酸調(diào)pH 至2.5）；流速為1.0mL/min；檢測波長為349nm，除雜質(zhì)Ⅱ為317nm；柱溫為25℃；進樣量為20μL；靈敏度試驗溶液中哌喹峰高信噪比應(yīng)＞10，系統(tǒng)適用性溶液中，理論塔板數(shù)按哌喹峰計算不低于1500，哌喹峰與雜質(zhì)Ⅰ峰分離度應(yīng)＞14。

系統(tǒng)適用性溶液：取哌喹與雜質(zhì)Ⅰ對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1mL 中分別含1.0mg 與0.005mg 的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.2 測定方法 取青蒿素哌喹片細粉適量，加流動相溶解并稀釋制成每1mL 中約含哌喹1mg 的溶液，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；精密量取1mL，置100mL 量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液；精密量取對照溶液1mL，置20mL 量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為靈敏度溶液。取雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ與雜質(zhì)Ⅲ對照品各約10mg，精密稱定，分別至20mL 量瓶中，加溶劑（雜質(zhì)Ⅰ加流動相、雜質(zhì)Ⅱ與雜質(zhì)Ⅲ加甲醇）溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對照品貯備液。分別精密量取雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對照品貯備液各1mL，置同一100mL 量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。精密量取上述溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的4 倍。

2.3 專屬性試驗

2.3.1 專屬性試驗 按處方比例配制供試品溶液、哌喹及不含哌喹的陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，各雜質(zhì)與主峰、雜質(zhì)與雜質(zhì)間分離度均達到要求，陰性不干擾測定，色譜圖見圖1-2。

2.3.2 強制降解試驗 取陰性（空白輔料+青蒿素）、哌喹原料、青蒿素哌喹片細粉適量（約相當于哌喹50mg）置50mL 棕色量瓶中，加入空白溶劑25mL 溶解，加入1mol/L HCL 溶液5mL，室溫放置24h 后，加入1mol/L NaOH 溶液5mL，用空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，續(xù)濾液作為酸破壞樣品。取陰性（空白輔料+青蒿素）、哌喹原料、青蒿素哌喹片細粉適量（約相當于哌喹50mg）置50mL 棕色量瓶中，加入空白溶劑25mL 溶解，加入1mol/L NaOH 溶液5mL，室溫放置24h 后，加入1mol/L HCL 溶液5mL，用空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，續(xù)濾液作為堿破壞樣品。取陰性（空白輔料+青蒿素）、哌喹原料、青蒿素哌喹片細粉適量（約相當于哌喹50mg）置50mL 棕色量瓶中，加入空白溶劑25mL 溶解，加30%過氧化氫1mL，放置1h 后加空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，續(xù)濾液作為氧化破壞樣品。各樣品置105℃干燥8h后，取陰性（空白輔料+青蒿素）、哌喹原料、青蒿素哌喹片細粉適量（約相當于哌喹50mg）置50mL 棕色量瓶中，加入空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，續(xù)濾液作為高溫破壞樣品。取陰性（空白輔料+哌喹）、哌喹原料、青蒿素原料、按處方比例配制的供試品適量（約相當于哌喹50mg）置50mL 透明量瓶中，加入空白溶劑25mL 溶解，于5500Lx 照度的光照箱中放置24h，取出用空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，續(xù)濾液作為光照破壞樣品。

圖1 專屬性試驗色譜圖（349nm）

圖2 專屬性試驗色譜圖（317nm）

按“2.1”項下色譜條件測定，各強制降解條件下空白溶液和空白輔料對本品制劑和原料藥有關(guān)物質(zhì)的檢測均無干擾；各強制降解條件下原料藥供試品溶液中主峰與各雜質(zhì)峰、各主要雜質(zhì)峰之間均能有效分離；各強制降解條件下制劑供試品溶液中主峰與各雜質(zhì)峰、各主要雜質(zhì)峰之間均能有效分離；酸、堿、氧化、高溫及強光降解條件下，哌喹原料供試品溶液的物料平衡指數(shù)分別為101.7%、101.6%、105.7%、100.8%和100.2%，制劑供試品溶液的物料平衡指數(shù)分別為98.9%、101.4%、104.0%、99.9%和100.8%；表明該方法對各主要降解雜質(zhì)均能較好檢出。該法能有效地檢出各破壞試驗產(chǎn)生的雜質(zhì)，且各雜質(zhì)峰均能與主峰達到基線分離，專屬性較好。

2.3.3 濾膜吸附 方法同“2.3.1”項下專屬性試驗。取未過濾的供試品溶液分別濾去1、2、3、5mL，取各過濾體積下的續(xù)濾液作為濾膜吸附性供試品溶液。另取未過濾的供試品溶液適量，離心后取上清液，作為濾過供試品溶液對照。結(jié)果表明，濾膜吸附性試驗中，供試品離心前后的主峰及各雜質(zhì)RSD%分別為主峰：0.5%，雜質(zhì)Ⅰ：0.9%，雜質(zhì)Ⅱ：2.7%，雜質(zhì)Ⅲ：0.5%，未知雜質(zhì)1：3.7%，均不＞5.0%。雜質(zhì)濾過后色譜峰面積回收率均在90%～110%之間，主峰回收率＞99%，說明濾膜吸附性影響較小，符合驗證要求。

2.4 檢測限與定量限 分別精密量取哌喹雜質(zhì)Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ對照品溶液適量，用空白溶劑逐步稀釋至各樣品主峰信噪比為3：1 和10：1，按“2.1”項下色譜條件測定，雜質(zhì)Ⅰ的定量限和檢出限分別為0.01、0.002μg/mL，雜質(zhì)Ⅱ的定量限和檢出限分別為0.02、0.004μg/mL，雜質(zhì)Ⅲ的定量限和檢出限分別為0.06、0.021μg/mL。哌喹雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的最低檢測限濃度均低于該雜質(zhì)的報告限度濃度，反映該分析方法的靈敏度符合要求。

2.5 線性關(guān)系及范圍 以雜質(zhì)限度為100%，從定量限開始至雜質(zhì)限度的400%，分別取6 個點，以濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸分析。分別精密稱量哌喹雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對照品適量，用空白溶劑溶解并稀釋至每1mL 含雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ約0.2g/L 的貯備溶液，逐步稀釋至濃度依次為定量限濃度（雜質(zhì)Ⅰ0.01，雜質(zhì)Ⅱ0.02，雜質(zhì)Ⅲ0.06），0.5、1.0、2.0、5.0、8.0μg/mL，按“2.1”項下色譜條件測定，回歸方程：雜質(zhì)Ⅰ：y=75.9099x+0.1914，R2=1.0000；雜質(zhì)Ⅱ：y=65.2220x+3.4801，R2=0.9999；雜質(zhì)Ⅲ：y=95.8359x-0.2231，R2=1.0000。各線性方程的相關(guān)系數(shù)（R2）均＞0.9990，Y 軸截距與100%濃度響應(yīng)值之比的絕對值為0.1%，＜2.0%。結(jié)果表明雜質(zhì)Ⅰ濃度在0.0102～8.1800μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，雜質(zhì)Ⅱ濃度在0.0205～8.1800μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，雜質(zhì)Ⅲ濃度在0.0597～7.9600μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 加樣回收率試驗 分別精密稱取青蒿素哌喹片細粉適量（約相當于哌喹100mg），置100mL 棕色量瓶中，加入各雜質(zhì)貯備液，用空白溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液，濃度分別為供試品總量限度的50%、100%和150%，每個濃度平行制備三份平行樣，按“2.1”項下色譜條件、“2.2”項下對照品溶液測定，計算加樣回收率。雜質(zhì)Ⅰ的加樣回收率（n=9）為95.3%～96.9%，RSD 為2.0%；雜質(zhì)Ⅱ的加樣回收率（n=9）為90.8%～100.4%，RSD 為4.8%；雜質(zhì)Ⅲ的加樣回收率（n=9）為93.4%～98.7%，RSD 為3.6%。各濃度平均回收率均在90%～110%間，相對標準偏差在10%內(nèi)，符合驗證要求。

2.7 精密度試驗 按“2.1”項下色譜條件、“2.2”項下對照品溶液測定，重復(fù)進樣6 次，計算哌喹雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ峰面積的RSD 均小于0.02%，符合精密度實驗要求。

2.8 重復(fù)性試驗 分別精密稱取青蒿素哌喹片細粉適量（約相當于哌喹50mg），置50mL 棕色量瓶中，用空白溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；平行制備6 份。按“2.1”項下色譜條件、“2.2”項下對照品溶液測定，計算哌喹雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量的RSD 均＜0.02%，符合重復(fù)性實驗要求。

2.9 溶液穩(wěn)定性試驗 取“2.8”項下供試品和對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別于0、4、8、16 和24h 測定，記錄色譜圖。24h 內(nèi)供試品溶液中雜質(zhì)Ⅰ、Ⅲ，未知雜質(zhì)1、2 峰面積的RSD 分別為3.8%、5.7%、3.7%和0.4%，均＜10%；24h 內(nèi)對照品溶液中雜質(zhì)Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ峰面積的RSD 分別為0.7%、0.3%和0.7%，均＜10%。各峰面積均未出現(xiàn)顯著性變化，結(jié)果符合驗證要求，表明溶液在24h 內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定。

2.10 耐用性試驗 分別考察了不同色譜柱[Thermo BDSnHYPERSILnC18（2）柱、YMC-Triart C18 柱]、不同流動相比例（乙腈-0.1%三氯乙酸-三乙胺=16:84:0.2，18:82:0.2，20:80:0.2）、不同流速（0.9，1.0，1.1mL/min）、不同三乙胺用量（0.1%、0.2%和0.3%）、不同柱溫（20、25、30℃）下各色譜峰間的分離度，結(jié)果表明，柱溫、流動相比例、pH 值會影響色譜峰，在樣品檢測時注意控制以上條件。

2.11 三批樣品測定 取三批中試樣品（20141001，20141002，20141003），按“2.2”項下方法制備供試品溶液與對照溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果見表1。

表1 三批樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果

3 討論

原方法采用自身對照法檢測，均按未知雜質(zhì)計算，檢出結(jié)果比實際要高，且信噪比均＜10，檢測靈敏度低，0.05%自身對照溶液幾乎不能檢出，檢測結(jié)果受外界影響大，可靠性不高。檢測波長（216nm）處于低波段，受到外界干擾較大。

新修訂方法采用原注冊申報方法的色譜條件（波長除外），參考中國藥典磷酸哌喹原料檢測波長，349nm 檢測未知雜質(zhì)、雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅲ，317nm 檢測雜質(zhì)Ⅱ，采用外標法檢測雜質(zhì)Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，結(jié)果準確度高。新修訂質(zhì)量標準增加了藥典中三個已知雜質(zhì)的控制，限度均按照原料標準執(zhí)行，不得過0.5%；未知雜質(zhì)參考ICH 及雜質(zhì)指導原則要求，不得過0.2%；總雜不得過2.0%，參考中國藥典磷酸哌喹原料標準執(zhí)行。依據(jù)方法驗證結(jié)果及方法對比結(jié)果，參考《中國藥典》2015 年版二部磷酸哌喹方法及化學藥物雜質(zhì)研究指導原則，制定已知雜質(zhì)Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ限度為0.5%；未知雜質(zhì)由原來1.0%限度收緊，制定為0.2%；總雜質(zhì)由原來2.5%收緊，制定為2.0%。

耐用性試驗顯示，柱溫微小變化（20～25℃）對同一批次有關(guān)物質(zhì)的測定結(jié)果影響不大，但達到30℃時雜質(zhì)Ⅱ與主峰分離度達不到要求；色譜柱選用要求較高，方法篩選中安捷倫ZORBAX-C18 柱主峰拖尾嚴重，推薦使用BDS HYPERSIL C18 或類似地適用于分離堿性含氮化合物色譜柱；流動相比例的微小變化會導致主峰保留時間延后、拖尾因子變大，影響未知雜質(zhì)檢出，三乙胺用量需要嚴格定量，多或少都會影響未知雜質(zhì)檢出。pH 值微小變化（pH 2.5～2.7）對同一批次有關(guān)物質(zhì)的測定結(jié)果影響不大，但pH 為2.3 時，主峰與雜質(zhì)Ⅱ分離度達不到要求。建議使用該方法應(yīng)注意流動相三乙胺用量、pH 值的控制要精準，以及要求使用固定品牌的色譜柱。