李愛鋒

摘 要：近幾年來(lái)，達(dá)托霉素需求量猛增，作為次級(jí)代謝產(chǎn)物，由于結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，達(dá)托霉素的產(chǎn)量極低。通過(guò)各種方法選育達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株，保證種子批的遺傳穩(wěn)定性，對(duì)于提高達(dá)托霉素生產(chǎn)質(zhì)量和產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本具有重要意義。大量試驗(yàn)表明，達(dá)托霉素在培養(yǎng)與保存過(guò)程中，可能會(huì)因培養(yǎng)液、保存環(huán)境等產(chǎn)生變異，從而降低甚至失去其在臨床醫(yī)學(xué)上較高的應(yīng)用價(jià)值，而研發(fā)性能穩(wěn)定、耐藥菌抑制效果更好的達(dá)托霉素，對(duì)達(dá)托霉素菌種進(jìn)行培養(yǎng)與篩選，獲得質(zhì)量好的菌種，降低菌種遺傳變異的機(jī)率，改良達(dá)托霉素的生產(chǎn)工藝和提升達(dá)托霉素的產(chǎn)量就必須要對(duì)達(dá)托霉素菌種的16SrRNA基因序列開展分析并對(duì)其遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)。立足筆者工作實(shí)際，本文致力于對(duì)恒瑞醫(yī)藥的原輔料達(dá)托霉素菌種實(shí)施檢驗(yàn)，確定恒瑞醫(yī)藥提供的菌種的遺傳穩(wěn)定性，為達(dá)托霉素的生產(chǎn)工藝優(yōu)化與產(chǎn)量提升提供支持。

關(guān)鍵詞：達(dá)托霉素;16SrRNA基因序列;遺傳穩(wěn)定性

1.前言

臨床醫(yī)學(xué)中，耐萬(wàn)古霉素糞腸球菌、耐萬(wàn)古霉素金黃色耐甲氧西林金黃色葡萄球菌以及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等是目前在醫(yī)院中傳播速率較快，致死率較高的病原體，由于抗生素濫用問(wèn)題越來(lái)越普遍，細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)，采用普通抗生素對(duì)這些細(xì)菌的滅殺作用效果甚微，一旦發(fā)生感染，患者病情難以控制，最終很有可能導(dǎo)致患者因感染加深而病情加深，甚至不治。達(dá)托霉素是一種新型環(huán)脂肽抗生素，主要用于治療耐藥革蘭氏陽(yáng)性菌造成的感染，能夠快速殺死絕大多數(shù)的細(xì)菌，不易受到其他抗生素所產(chǎn)生的交叉耐藥性的影響，市場(chǎng)前景一片廣闊，被譽(yù)為制劑簡(jiǎn)單、對(duì)耐藥菌抑制效果良好、毒素作用小抗生素之一。

2013年，達(dá)托霉素在美國(guó)上市，被批注能用于治療皮膚結(jié)構(gòu)感染與復(fù)雜皮膚感染，如皮膚潰瘍和術(shù)后切口感染，以及革蘭陽(yáng)性菌引起的各種嚴(yán)重感染，其中就包括了對(duì)甲氧西林敏感的右側(cè)心內(nèi)膜炎，菌落獲得性肺炎和VRE感染。其副作用較小，安全性頗高，被臨床醫(yī)學(xué)界譽(yù)為耐藥菌感染的最后一道防線。

據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)顯示，2016年，達(dá)托霉素的全球銷量超過(guò)了20億美元。同年，我國(guó)食品藥品監(jiān)督總局批準(zhǔn)華東醫(yī)藥和恒瑞醫(yī)藥生產(chǎn)達(dá)托霉素，學(xué)術(shù)研究界及醫(yī)藥行業(yè)致力于研究達(dá)托霉素的工業(yè)批量生產(chǎn)方法，就目前而言，發(fā)酵法依然是達(dá)托霉素生產(chǎn)中最為重要的方法，但菌種培養(yǎng)過(guò)程中，很可能由于外界因素的變化而影響達(dá)托霉素的遺傳穩(wěn)定性，所以，對(duì)菌種實(shí)施16SrRNA基因序列分析和遺傳穩(wěn)定性檢驗(yàn)是必要的。

2 達(dá)托霉素的概述

2.1達(dá)托霉素的結(jié)構(gòu)

達(dá)托霉素是一種由玫瑰孢鏈霉菌發(fā)酵而來(lái)的環(huán)脂肽結(jié)構(gòu)的新型抗生素，臨床上屬于脂蛋白抗生素，達(dá)托霉素分子由連接到一個(gè)環(huán)狀 13 - 氨基酸肽的 N - 末端色氨酸上的癸?；鶄?cè)鏈構(gòu)成。

達(dá)托霉素天然存在于土壤腐生營(yíng)養(yǎng)玫瑰孢鏈霉菌發(fā)酵液中的，生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域采用各種方法提取而來(lái)，作為玫瑰孢鏈霉菌經(jīng)過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生一組脂多肽混合物，色氨酸N的末端含有不同長(zhǎng)度的脂肪鏈，是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)脂肪類抗生素。

化學(xué)分子式是C72H101N17O26，分子量為1620.67，精確質(zhì)量為1619.71，熔點(diǎn)在202-204oC之間。被作為醫(yī)藥中間體，應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)中，注射試劑呈現(xiàn)為微淺黃色或黃色的晶體粉末，較易溶解于水，在堿性溶液和酸性溶液中可大量溶解，也較易溶解于小分子的有機(jī)溶劑中。

2.2達(dá)托霉素的作用機(jī)制

關(guān)于達(dá)托霉素的具體作用機(jī)制，目前并沒(méi)有較為權(quán)威的定論，就目前的研究結(jié)果而言，僅能證明達(dá)托霉素是一種Ca2+依賴性抗生素，與其他類型抗生素的作用機(jī)制有明顯的差別，達(dá)托霉素雖不能穿透細(xì)胞膜，但在與Ca2+結(jié)合之后，達(dá)托霉素將以非共價(jià)鍵的形式結(jié)合到細(xì)胞膜蛋白上，細(xì)胞膜上的達(dá)托霉素結(jié)合蛋白成為其作用靶位，達(dá)托霉素親脂尾部在細(xì)胞膜上起到了“離子通道”的作用，能夠阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁中脂類物質(zhì)的生物合成，從破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，導(dǎo)致內(nèi)容物溢出，而達(dá)到細(xì)菌深度滅殺的效果，因此，最大限度的避免了細(xì)菌瘋狂繁殖而導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。達(dá)托霉素良好的耐藥性正源于其特殊的作用機(jī)制，生物制藥公司的試驗(yàn)階段，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)達(dá)托霉素對(duì)其他類型的抗生素有不利影響，臨床實(shí)驗(yàn)階段，也并未發(fā)生達(dá)托霉素于其他類型抗生素的交叉耐藥問(wèn)題。

臨床試驗(yàn)表明，達(dá)托霉素溶于水后非常穩(wěn)定，在室溫條件下可保存長(zhǎng)達(dá)7天，但在酸堿性發(fā)生變化時(shí)，達(dá)托霉素也較為容易變性，這種變性是不可逆的[4]，從目前的應(yīng)用效果來(lái)看，因各種原因引起的耐藥在臨床實(shí)驗(yàn)中是較為罕見的。

2.3達(dá)托霉素的生產(chǎn)

目前，用于治療威脅身體系統(tǒng)乃至生命的革蘭氏陽(yáng)性菌所造成的各種感染的達(dá)托霉素的生產(chǎn)，有三種方法：微生物發(fā)酵法、生物合成法和化學(xué)合成法。

微生物發(fā)酵是目前應(yīng)用中最重要的方法，采用較多的為前體誘導(dǎo)法，在玫瑰孢鏈霉菌發(fā)酵的過(guò)程中，添加癸酸，令達(dá)托霉素的前體A21978C通過(guò)?；饔茫c癸酸產(chǎn)生連接，合成最終的達(dá)托霉素。實(shí)驗(yàn)表明，加入癸酸使得達(dá)托霉素的產(chǎn)量獲得了大幅提升。但在實(shí)際生產(chǎn)中，利用天然發(fā)酵的方法來(lái)生產(chǎn)達(dá)托霉素，產(chǎn)量顯然無(wú)法滿足市場(chǎng)需求，研究學(xué)者開始探索達(dá)托霉素培養(yǎng)基，采用激光誘變、代謝網(wǎng)絡(luò)分析等工藝，提升達(dá)托霉素的產(chǎn)量，效果顯著。

化學(xué)合成法要突破氨基酸單體的來(lái)源過(guò)少的問(wèn)題，由于達(dá)托霉素結(jié)構(gòu)中含有非蛋白氨基酸和D型氨基酸，大量學(xué)者要需要繞過(guò)疑難問(wèn)題，繞過(guò)國(guó)外專利保護(hù)，突破性的進(jìn)行合成，雖然我國(guó)徐紅巖和欽傳光采用不同方法合成了達(dá)托霉素，但由于的操作復(fù)雜、成本較高的問(wèn)題，目前還未能實(shí)現(xiàn)工業(yè)批量生產(chǎn)。

生物合成法的探索，國(guó)內(nèi)研究學(xué)者投入了巨大精力，達(dá)托霉素是一種非核糖體合成的抗生素，研究學(xué)者解決了達(dá)托霉素合成基因簇的結(jié)構(gòu)與功能，并且利用對(duì)遺傳基因簇的遺傳性操作，試圖尋找出比達(dá)托霉素更具優(yōu)勢(shì)的衍生物，由于還處于研究試驗(yàn)階段，也未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

3.達(dá)托霉素批的16SrRNA基因序列分析和遺傳穩(wěn)定性檢驗(yàn)

3.1 實(shí)驗(yàn)材料

3.1.1 菌種

由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供的樣品MS-1，原輔料達(dá)托霉素種子批。

3.1.2 主要培養(yǎng)基、試劑及緩沖液配置

2升LB培養(yǎng)基的配制：分別稱取氯化鈉（AR）20.0克，胰化蛋白胨（CP）20.0克，酵母抽提物（CP）10.0克于2升潔凈干燥的刻度燒杯中，加入約1.8升蒸餾水，用玻璃棒攪拌至溶解均勻，再用蒸餾水定容至2.0 升。

磷酸鹽母液配方：340mmol/L KH2PO4/1.44 mol/L K2HPO4的溶液4.62g的磷酸二氫鉀和25.08g磷酸氫二鉀（32.86g K2HPO4.3H2O）溶在足量的水中，使終體積為100ml。

Platinum R TaqDNA聚合酶、緩沖液體系、定制引物均由LifeTechnologiesTM提供;TA克隆使用的是TAKARA的pMDTM18-TVectorCloningKit;基因組DNA提取試劑盒，凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒小抽試劑盒均由上海碩美生物提供。

3.1.3 培養(yǎng)基分裝滅菌處理

將配好的培養(yǎng)基溶液分裝于專用試劑瓶?jī)?nèi)，蓋緊瓶蓋后再將瓶蓋擰松一圈（防止高壓下瓶子爆裂），并在瓶蓋外包上鋁箔紙。同批培養(yǎng)基若有不同種類，標(biāo)注特別標(biāo)識(shí)。

把裝有培養(yǎng)基的試劑瓶放入滅菌鍋內(nèi)滅菌，設(shè)定滅菌溫度為121攝氏度、時(shí)間為20分鐘、壓力控制在0.1-0.15MPa。滅菌完畢后，從滅菌鍋中取出試劑瓶，將其冷卻至室溫（不燙手便可）后，將瓶蓋擰緊，放入冰箱中冷藏備用。

3.1.4 培養(yǎng)基加入抗生素處理

實(shí)驗(yàn)前，分別在上述已經(jīng)冷卻的培養(yǎng)基中加入一定體積的AMP/KAN儲(chǔ)備液，配成AMP/KAN抗生素培養(yǎng)基。

其它抗生素培養(yǎng)基在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中加入，在無(wú)抗性的培養(yǎng)基中加入一定體積的儲(chǔ)備液，具體添加儲(chǔ)備液濃度、加藥量、加水量、加乙醇量、培養(yǎng)基中儲(chǔ)備液加入量如下表所示。

儲(chǔ)備液的配制溶劑為乙醇（AR）或去離子水，自行保存管理，放置于冰箱冷凍室進(jìn)行保存，保存期限為六個(gè)月。

3.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器

采用ABI9700型PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用ABI3730XL型DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

3.2 16SrRNA基因序列分析試驗(yàn)方法

3.2.1 試驗(yàn)步驟

按照以下的方法步驟，開展16SrRNA基因序列分析：

第一步 根據(jù)目的序列設(shè)計(jì)并合成16s序列，引物序列如下圖;

第二步 按試劑盒說(shuō)明操作，從提供的菌體中提取出基因組DNA;

第三步 以提取的模板和設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物;

第四步 產(chǎn)物直接測(cè)序，雙向引物測(cè)通，同時(shí)進(jìn)行TA克隆;

第五步 TA克隆測(cè)序結(jié)果出來(lái)后與產(chǎn)物結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，是否一致;

第六步 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast，并展示結(jié)果。

3.2.2 結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

（1）鑒定結(jié)果

鑒定結(jié)果如圖1所示（圖a為DL2000標(biāo)準(zhǔn)maker，圖b為pcr產(chǎn)物跑膠鑒定結(jié)果及與maker的對(duì)比），電泳跑膠結(jié)果顯示片段大小在1500bp左右，與16S rRNA序列理論大小一致。

（2） 樣品MS-1測(cè)定序列

樣品MS-1測(cè)定序列如下表所示：

（3）Blast結(jié)果

通過(guò)NCBI網(wǎng)站進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)， Blast結(jié)果如下表所示：

3.3 遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)試驗(yàn)方法

3.3.1 試驗(yàn)步驟

按照以下的方法步驟，開展遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)試驗(yàn)：

第一步 根據(jù)目的序列設(shè)計(jì)并合成特異引物，引物序列如下表;

第二步 按試劑盒說(shuō)明操作，從提供的菌體中提取出基因組DNA;

第三步以提取的模板和設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物;

第四步產(chǎn)物可以直接測(cè)序，雙向引物測(cè)通，同時(shí)進(jìn)行TA克隆;

第五步TA克隆測(cè)序結(jié)果出來(lái)后與產(chǎn)物結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，是否一致;

第六步對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast，并展示結(jié)果。

3.3.2 結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

（1）鑒定結(jié)果

鑒定結(jié)果如圖2所示（圖a為DL2000標(biāo)準(zhǔn)maker，圖b為pcr產(chǎn)物跑膠鑒定結(jié)果及與maker的對(duì)比）： 電泳跑膠結(jié)果顯示片段大小在700bp左右，與分析遺傳穩(wěn)定性的特征序列理論大小一致。

（2）樣品MS-1測(cè)定序列

樣品MS-1測(cè)定序列如下表所示：

（3）Blast結(jié)果

NCBI網(wǎng)站進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)，結(jié)果如下表：

結(jié)論：目的條帶明顯，大小在600-700bp左右，與Streptomyces 菌株同源性最高為99%。

4.結(jié)論與討論

測(cè)得16S rRNA序列與Streptomyces 菌株同源性最高為99%，NCBI網(wǎng)站進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)，Streptomycessp同源性達(dá)到99.86%。表明江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供的樣品MS-1，原輔料達(dá)托霉素種子批是能夠穩(wěn)定表達(dá)和傳代的菌株，可用于醫(yī)藥工業(yè)批量生產(chǎn)中。

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