崔慶

摘 要：本試驗旨在探討A酸、C酸和酸無窮對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌體外抑菌效果的影響。試驗選用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌三種常見致病菌作為指示菌，酸化劑A酸、C酸和酸無窮的濃度分別設(shè)置為0.4、0.5、0.7、0.9、1.1 g/mL，每個處理3個重復(fù)，通過牛津杯法測定抑菌圈大小，來評估不同濃度水平A酸、C酸、酸無窮對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的體外抑菌效果。結(jié)果表明：A酸、C酸和酸無窮對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌均產(chǎn)生顯著的抑菌效果（P < 0.05），酸無窮對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果顯著優(yōu)于A酸（P < 0.05），A酸和酸無窮對三種菌的抑菌效果均顯著優(yōu)于C酸（P < 0.05）；隨著酸化劑的濃度升高，酸化劑的抑菌效果顯著增強（P < 0.05）；不同濃度水平的酸化劑對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果差異顯著（P < 0.05）。1.1 g/mL酸無窮對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果最好（P < 0.05），1.1 g/mLA酸對沙門氏菌的效果最好（P < 0.05）。

關(guān)鍵詞：酸化劑；金黃色葡萄球菌；沙門氏菌；大腸桿菌；體外抑菌

前 言

使用抗生素具有殘留性和耐藥性等負面作用，為了維持養(yǎng)殖業(yè)高水平生產(chǎn)力，尋找抗生素替代物已成為動物營養(yǎng)研究領(lǐng)域的重點問題之一。

酸化劑安全、無污染、無殘留，能夠降低飼料和動物胃腸道中的pH值，主要是由有機酸、鹽類和無機酸組成。不僅具有提高飼料利用率、改善動物生產(chǎn)性能的作用，還具有抑制有害微生物的活動和繁殖、促進有益菌的生長，改善動物胃腸道內(nèi)微生物區(qū)系，保護動物胃腸道黏膜健康、增強動物免疫機能等作用[1]，作為抗生素替代品在畜禽養(yǎng)殖過程中得到了廣泛應(yīng)用。

研究表明，在飼料中添加檸檬酸，大腸桿菌的數(shù)量減少，乳酸桿菌的數(shù)量增加，仔豬腹瀉率降低[10]。苯甲酸可以降低仔豬胃腸道pH值，并增加揮發(fā)性脂肪酸。富馬酸是三羧酸循環(huán)有氧過程的重要組分，能調(diào)節(jié)機體內(nèi)酶活性和能量代謝等一系列生化反應(yīng)[13]。雖然目前有很多關(guān)于不同有機酸之間以及有機酸和復(fù)合酸之間抑菌效果的比較研究，但是對于復(fù)合酸化劑之間的抑菌效果的比較研究很少。通過把有機酸和無機酸結(jié)合，利用酸化劑解離度不同，在幾種酸的協(xié)同作用下形成抑菌譜更廣的復(fù)合酸化劑，來達到增強抑菌效果的目的[11，5]。此外，還有研究表明，復(fù)合酸化劑的種類和配比不同，對仔豬腸道微生物區(qū)系的影響也會有所不同[2，4]。本研究選用不同配比的復(fù)合酸化劑A酸、C酸和酸無窮，選取金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌作為指示菌，通過體外實驗評定3種復(fù)合酸化劑對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果，為不同復(fù)配酸化劑在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

A酸、C酸和酸無窮購自四川建奇飼料有限公司，酸化劑成分組成見表1。

1.2 試驗菌種

金黃色葡萄球菌（ATCC65213）、沙門氏菌（ATCC21512）和大腸桿菌（ATCC83912）來自西南民族大學動物營養(yǎng)與飼料科學專業(yè)實驗室。

1.3 試驗儀器

BSA 124 S-CW電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；GHP-9270恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）；牛津杯 內(nèi)徑（6.0±0.1）mm、外徑（7.8±0.1）mm（成都市科隆化學品有限公司）；SW-CJ-2 FD無菌操作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；SYQ-DSX-280 B壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；THZ-98 C 恒溫搖床機（上海一恒科學儀器有限公司）；DHG-9140 A電熱恒溫鼓風烘箱（上海三發(fā)科學儀器有限公司）；UV 1810 S分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；

1.4 試驗方法

1.4.1 培養(yǎng)基的配制

瓊脂培養(yǎng)基的配制：取瓊脂3 g于錐形瓶中，加入超純水至200 mL，置于滅菌鍋在121 ℃條件下進行滅菌15 min。

液體培養(yǎng)基的配制：取胰蛋白胨3 g、氯化鈉3 g、酵母粉1.5 g于錐形瓶中，加入超純水至300 mL，置于滅菌鍋121 ℃條件下進行滅菌15 min。

固體培養(yǎng)基的配制：取胰蛋白胨3 g、氯化鈉3 g、酵母粉1.5 g、瓊脂4.5 g于錐形瓶中，加入超純水至300 mL置于滅菌鍋121 ℃條件下進行滅菌15 min。

1.4.2 菌種的活化

從-70 ℃冰箱中取出冷藏的菌種，用接種環(huán)挑取一環(huán)菌落到20 mL液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h。從第一次活化的菌液里取1 mL加到10 mL液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)2 h，用紫外可見光分光光度計測定OD值，進行第二次活化，對菌液的搖床活化進行直至用紫外可見光分光光度計測量OD值達到0.5（0.45～0.55），記錄數(shù)據(jù)，作為指示菌。

1.4.3 酸溶液的制備

分別稱取0.16 g、0.20 g、0.28 g、0.36 g、0.44 g的A酸、C酸和酸無窮，用超純水稀釋至濃度依次為0.4、0.5、0.7、0.9、1.1 g/mL的酸溶液，隨后進行水浴加熱，加熱后紫外滅菌備用。

1.4.4 抑菌試驗

將滅菌后的瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，置于無菌操作臺冷卻凝固后，在無菌條件下放入經(jīng)過滅菌的牛津杯，輕輕按壓，使牛津杯穩(wěn)固。取指示菌液200 uL到滅菌后的液體培養(yǎng)基中搖勻，倒入穩(wěn)固牛津杯的瓊脂培養(yǎng)基中，待冷卻后取出牛津杯。分別加入100 uL的各個濃度的酸溶液，每一濃度下的酸溶液設(shè)置3個重復(fù)。隨后，置于GHP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱37 ℃下恒溫培養(yǎng)6～9 h，觀察出圈情況，待抑菌圈形成后，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，計算平均值。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS軟件分析，對不同酸化劑對三種菌抑菌效果的影響和不同濃度水平的酸化劑對三種菌抑菌效果的影響進行二因素方差分析，對不同濃度水平的A酸、C酸和酸無窮對三種菌抑菌效果的影響分別進行單因素方差分析，并用Duncan法進行多比較，結(jié)果采用平均值形式表示，其中P > 0.05表示差異不顯著，P < 0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

表2可知，A酸、C酸和酸無窮對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果差異顯著（P < 0.05）；酸無窮對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果顯著優(yōu)于A酸和C酸（P < 0.05），A酸對沙門氏菌的抑菌效果顯著優(yōu)于C酸和酸無窮（P < 0.05）；不同濃度的A酸、C酸和酸無窮對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果差異顯著（P < 0.05），隨著濃度水平提高，酸化劑對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果增強（P < 0.05），濃度為1.1 g/mL時，酸化劑的抑菌效果最好；酸化劑種類和濃度二因素對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果有顯著的互作影響（P < 0.05），濃度水平為1.1 g/mL的A酸對沙門氏菌的抑菌效果最好（P < 0.05），濃度水平為1.1 g/mL的酸無窮對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果最好（P < 0.05）。

3 討論

致病性金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌可引起畜禽腸道等疾病，是危害養(yǎng)殖業(yè)的重要病原。酸化劑具有抑制有害微生物的活動和繁殖、促進有益菌的生長，改善胃腸道內(nèi)微生物區(qū)系，保護動物胃腸道黏膜健康、增強動物免疫機能等作用[1]。酸化劑的抑菌機制主要有兩個方面。第一，酸通過自由擴散的方式進入菌體細胞，在細胞內(nèi)解離出的氫離子和酸根離子不能通過自由擴散的方式跨膜，導(dǎo)致氫離子在胞內(nèi)集聚，細胞質(zhì)pH降低，迫使細菌通過主動運輸釋放細胞內(nèi)氫離子，恢復(fù)胞質(zhì)pH平衡，確保酶的作用，這個過程消耗大量ATP，與細菌正常生長代謝產(chǎn)生能量競爭。酸根離子聚集，改變胞內(nèi)內(nèi)環(huán)境，并通過細胞遺傳信息傳遞干擾細菌的DNA合成、造成細菌代謝途徑發(fā)生改變、細胞的代謝活性受到抑制[6]，此外，由于細胞內(nèi)滲透壓升高，細胞必須釋放帶負電荷的離子，如細菌生長所必需的前體物質(zhì)來平衡胞內(nèi)滲透壓，從而抑制細菌正常生長。第二，未解離的有機酸可以與菌體膜發(fā)生作用，破壞了菌體膜的完整性，導(dǎo)致內(nèi)容物外泄，動物胃腸道的pH值降低，病原菌的生長環(huán)境受到破壞，從而達到抑菌目的[1]。

在本試驗結(jié)果中，A酸、C酸和酸無窮對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果均為顯著，驗證了酸化劑的抑菌作用。其中，0.4 g/mL是A酸、C酸和酸無窮對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度；隨著濃度的增加，抑菌圈越大，抑菌效果越明顯[9]。0.7 g/mL～1.1 g/mL時，A酸、C酸和酸無窮對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌均有明顯的抑菌效果；1.1 g/mL是最佳的抑菌濃度。

酸化劑主要由無機酸、有機酸和鹽類組成。許多研究表明，將有機酸和無機酸混合可以產(chǎn)生互補協(xié)同效應(yīng)，將在不同pH范圍內(nèi)作用的幾種酸復(fù)合在一起，可以形成抑菌譜更廣的復(fù)合酸化劑，增強抑菌效果[11]。

在本試驗中，A酸、C酸和酸無窮均為復(fù)合型酸化劑，雖然三種酸化劑的成分組成有所區(qū)別，但均對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌有顯著的抑菌效果。其中，苯甲酸對大多數(shù)微生物有抑制作用，在 pH值為5.0和5.5的條件下，高濃度的苯甲酸對大腸桿菌有明顯地抑制效果[3]。富馬酸是三羧酸循環(huán)有氧過程的重要組分，能調(diào)節(jié)機體內(nèi)酶活性和參與能量代謝等一系列生化反應(yīng)[13]，其作用機制主要是富馬酸穿過微生物細胞膜阻止DNA的合成來減少微生物菌群，或者抑制微生物的三羧酸循環(huán)來達到抑菌的目的，因此具有雙重抑菌效果[12，5]。檸檬酸能降低細胞間質(zhì)的pH，抑制細菌生長[8]。利用酸化劑解離度存在差異，可以使用一些解離度大的酸來降低 pH，選擇一些解離度小的酸來抑菌，在幾種酸的協(xié)同作用下來達到抑菌的目的[5]，如苯甲酸屬于解離度大的酸，可降低溶液的 pH 值，富馬酸的解離度比較小，可有效協(xié)同抑菌。在此基礎(chǔ)上，A酸中的磷酸組分高于C酸和酸無窮，磷酸可以使飼料的pH值很快下降，增強抑菌效果，所以1.1 g/mL的A酸對沙門氏菌的抑菌效果最好；酸無窮在A酸和C酸成分組成的基礎(chǔ)上增加甲酸、乙酸和丙酸成分，揮發(fā)性有機酸通過消耗菌體ATP參與能量競爭或者抑制DNA等生物大分子合成而發(fā)揮抑菌作用[7]，通過綜合幾種酸的抑菌機理，抑菌效果得到增強，所以1.1 g/mL的酸無窮對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果最好。

4 結(jié)論

A酸、C酸和酸無窮對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌均產(chǎn)生顯著的抑菌效果，酸無窮對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果最優(yōu)，A酸對沙門氏菌的抑菌效果最好；隨著酸化劑的濃度升高，酸化劑的抑菌效果顯著增強；不同濃度的酸化劑對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的體外抑菌效果差異顯著；濃度為1.1 g/mL的酸無窮對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果最好，濃度為1.1 g/mL的A酸對沙門氏菌的效果最好。

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（作者單位：西南民族大學 生命科學與技術(shù)學院）