齊玉

摘 要：在測(cè)定乳制品蛋白質(zhì)含量的方法中，傳統(tǒng)的凱氏定氮法無法甄別人為添加非蛋白氮的劣質(zhì)乳制品，給一些不法生產(chǎn)者提供了可乘之機(jī)，讓劣質(zhì)乳制品流入市場(chǎng)。文章對(duì)乳和乳制品蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)方法進(jìn)行研究，分別采用凱氏定氮法和雙縮脲比色法兩種方法檢測(cè)乳制品中蛋白質(zhì)含量，對(duì)比分析其具體測(cè)定過程及結(jié)果，為相關(guān)食品檢驗(yàn)工作提供參考。

關(guān)鍵詞：人為添加;非蛋白質(zhì)氮乳;乳制品;蛋白質(zhì)含量;測(cè)定方法

1 前言

近年來，不法商販依靠向乳與乳制品中添加非蛋白質(zhì)氮通過檢驗(yàn)的案例時(shí)有發(fā)生。最惡劣的一次是某品牌奶粉添加了三聚氰胺物質(zhì)，對(duì)消費(fèi)者的身體健康造成極大傷害。為防止此類事件再次發(fā)生，必須實(shí)現(xiàn)對(duì)非蛋白質(zhì)氮和乳制品蛋白質(zhì)檢測(cè)的有效區(qū)分，從而準(zhǔn)確測(cè)定乳制品中的蛋白質(zhì)含量，杜絕劣質(zhì)產(chǎn)品進(jìn)入市場(chǎng)。

2 乳制品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定概述

乳蛋白中含有多種人體必需氨基酸，是乳制品中的重要營(yíng)養(yǎng)成分，因此蛋白質(zhì)含量是檢驗(yàn)乳制品質(zhì)量的重要指標(biāo)，GB 25190-2010中規(guī)定牛乳蛋白含量不低于0.029 g/g，GB 19644-2010中規(guī)定調(diào)制乳粉蛋白含量不低于0.165 g/g等，乳制品蛋白含量的準(zhǔn)確測(cè)定是乳制品產(chǎn)品安全的重要保障[1]。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法有很多種，傳統(tǒng)的測(cè)定方法多為凱氏定氮法，該方法由丹麥科學(xué)家率先提出，一直沿用至今。凱氏定氮法的測(cè)定原理是利用樣品中蛋白質(zhì)在催化加熱的條件下分解產(chǎn)生的氨與濃硫酸反應(yīng)，生成硫酸銨，堿化蒸餾使氨游離，經(jīng)硼酸吸收后用硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量計(jì)算氮含量，再乘以轉(zhuǎn)換系數(shù)，確定蛋白質(zhì)含量。但是該方法并不能給出真實(shí)的蛋白質(zhì)含量，由于含氮有機(jī)物不僅僅有蛋白質(zhì)，還有三聚氰胺等，凱氏定氮法并不能對(duì)兩者進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。因此，一些不法生產(chǎn)者為謀取高額利潤(rùn)，人為的在乳制品中添加尿素、三聚氰胺和化肥等非蛋白質(zhì)氮，以提高蛋白質(zhì)含量檢測(cè)數(shù)值，使劣質(zhì)產(chǎn)品也能通過乳制品蛋白質(zhì)檢驗(yàn)。在《乳與乳制品蛋白質(zhì)的測(cè)定——雙縮脲比色法》（NY/T1678-2008）中規(guī)定了另一種乳制品蛋白質(zhì)測(cè)定方法，即雙縮脲比色法[2]。其原理是，利用三氯乙酸沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，在堿性條件下，含肽鍵化合物與銅離子反應(yīng)生成紫紅色絡(luò)合物，將其在540 nm下進(jìn)行吸光度測(cè)定，采用外標(biāo)法定量，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。這種方法可以排除尿素、三聚氰胺等人為添加非蛋白氮的影響，蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確。

3 測(cè)定材料及方法

3.1 材料與試劑

試驗(yàn)所需材料與試劑包括以下幾種。①凱氏定氮法所需的材料與試劑。市購(gòu)液態(tài)奶，純度高于99%的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，水解蛋白、尿素、三聚氰胺、甘氨酸、95%乙醇、硫酸鉀、硫酸銅、濃硫酸、硼酸溶液、甲基紅、溴甲酚綠、氫氧化鈉溶液及鹽酸。②雙縮脲比色法所需的材料與試劑。市購(gòu)液態(tài)奶，95%乙醇、濃硫酸、鹽酸、硫酸銅、氫氧化鉀、硫酸鉀、氫氧化鈉、三氯乙酸、甲基紅、四氯化碳及溴甲酚綠等。所用試劑皆為分析純，試驗(yàn)用水為三級(jí)水。

3.2 儀器與設(shè)備

采用凱氏定氮法和雙縮脲比色法對(duì)乳制品蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，需要采用感量為1 mg的分析天平、消煮爐、自動(dòng)凱氏定氮儀、離心機(jī)、超聲波清洗器和分光光度計(jì)等。

3.3 方法與過程

3.3.1 凱氏定氮法對(duì)乳制品蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

在樣品前處理過程中，用分析天平準(zhǔn)確稱取2 g液體乳，共需要5份，向其中4份分別加入水解蛋白、尿素、三聚氰胺和甘氨酸各10 mg，再加入6 g硫酸鉀、0.4 g硫酸銅、20 mL濃硫酸，在消煮爐中消化、放冷。然后取等量硫酸鉀、硫酸銅和濃硫酸做空白試驗(yàn)。在測(cè)定過程中，首先在消化管中加50 mL水，然后于自動(dòng)凱氏定氮儀上進(jìn)行自動(dòng)加液、蒸餾，滴定并記錄數(shù)據(jù)，完成試驗(yàn)后，用公式X=[（V1-V2）×c×0.014]/m×F×100對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行計(jì)算。其中V1為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液體積，V2為空白試劑消耗的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液體積，c為滴定溶液濃度，m為試樣質(zhì)量，F(xiàn)為蛋白質(zhì)換算系數(shù)。

3.3.2 雙縮脲法對(duì)乳制品蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

稱取液體乳后，向其中分別添加水解蛋白、尿素、三聚氰胺和甘氨酸各10 mg，在50 mL離心管中加入10 mL三氯乙酸混勻。靜止10 min后，在10 000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min。然后傾去上層清液，經(jīng)10 mL 95%乙醇洗滌，向沉淀加入20 mL雙縮脲試劑和2 mL四氯化碳，經(jīng)過超聲波清洗器振蕩溶解，顯色10 min后再次離心處理20 min。取上層清液，在540 nm下對(duì)其的吸光度進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白質(zhì)含量，計(jì)算公式為X=2c/m0，其中X為樣品蛋白

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質(zhì)含量，單位是g/g，C為蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，單位是mg/mL，m0為樣品質(zhì)量，單位為g。

4 測(cè)定結(jié)果分析

4.1 雙縮脲比色法

采用上述方法完成試驗(yàn)后，可以繪制酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定曲線。結(jié)果顯示酪蛋白的質(zhì)量濃度在0.2～3.0 mg/mL范圍內(nèi)，與溶液吸光度值的線性關(guān)系較好。

4.2 凱氏定氮法

采用凱氏定氮法測(cè)定的各組非蛋白質(zhì)物質(zhì)添加量如表1所示。

4.3 不同方法的測(cè)定結(jié)果對(duì)比

采用不同方法對(duì)乳制品蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果如表2所示，從結(jié)果來看，傳統(tǒng)凱氏定氮法測(cè)定未添加非蛋白氮樣品的結(jié)果為0.031 8 g/g，雙縮脲比色法的測(cè)定結(jié)果為0.031 4g/g。凱氏定氮法測(cè)定加入非蛋白氮樣品的結(jié)果則明顯高于雙縮脲比色法的測(cè)定結(jié)果，其測(cè)定結(jié)果在0.041 8～0.045 6g/g范圍內(nèi)，而雙縮脲比色法在0.031 0～0.032 2 g/g范圍內(nèi)。

基于食品檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、科學(xué)性的考慮，為了避免人為添加了非蛋白質(zhì)氮的劣質(zhì)乳制品蒙混過關(guān)，必須采用有效的測(cè)定方法，對(duì)乳與乳制品中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。從而排除添加水解蛋白、尿素、三聚氰胺等物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果的影響，分析上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，雙縮脲比色法對(duì)蛋白質(zhì)含量的測(cè)試結(jié)果優(yōu)于傳統(tǒng)的凱氏定氮法，規(guī)避了傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法的弊端，完善了乳制品檢測(cè)機(jī)制，為營(yíng)造更安全的乳制品市場(chǎng)提供重要保障。。因此，針對(duì)人為添加非蛋白質(zhì)氮這種違規(guī)違法行為的存在，采取能夠區(qū)分兩者的測(cè)定方法是十分必

要的。

5 結(jié)語

綜上所述，傳統(tǒng)采用的凱氏定氮法實(shí)際是對(duì)總氮含量的測(cè)定，無法區(qū)分非蛋白質(zhì)氮和蛋白質(zhì)氮，因此難以對(duì)人為添加非蛋白質(zhì)氮的行為加以識(shí)別和控制。通過采用雙縮脲比色法進(jìn)行乳制品蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，可以解決這一問題，保障乳與乳制品食品安全檢測(cè)的有效性。

參考文獻(xiàn)

[1]劉琳，鄭波.電流法測(cè)定乳制品中真蛋白含量的方法探究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2016，26（14）：2013-2014.

[2]劉慶，王凡余，李剛.乳制品中蛋白質(zhì)檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)儀器，2014，12（Z1）：43-46.