胡麗玲 劉世柱 吳志君 周曉云 陳雯雯

水提法同步提取分離香菇中蛋白質(zhì)和多糖的工藝研究

胡麗玲 劉世柱 吳志君 周曉云 陳雯雯

（浙江方格藥業(yè)有限公司，浙江 慶元 323800）

通過水提法同步提取分離香菇中的蛋白質(zhì)和多糖，采用單因素實(shí)驗(yàn)研究料液比、提取溫度、提取時(shí)間與蛋白質(zhì)和多糖提取率的關(guān)系，并通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝條件。結(jié)果為，影響蛋白質(zhì)提取率的主次因素為提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間；影響多糖提取率的主次因素為料液比＞提取溫度＞提取時(shí)間。綜合分析得到提取的最佳工藝組合為料液比20、提取溫度100 ℃、提取時(shí)間3.5 h（二次提?。?。該組合下蛋白質(zhì)提取率為6.90%，多糖提取率達(dá)38.50%。

香菇；蛋白質(zhì)；多糖；提取率；影響因素

香菇，又名花菇、冬菇等，屬擔(dān)子菌綱傘菌目口蘑科香菇屬，是世界上第二大食用菌品種[1]。其味道鮮美，含有豐富的多糖和蛋白質(zhì)，藥用價(jià)值高，是一種集營養(yǎng)、保健和藥用價(jià)值于一體的藥食兩用真菌[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，香菇多糖具有抗病毒[3]、抗腫瘤[4]、抗疲勞[5]等多方面的生物活性，可提高機(jī)體免疫力，對(duì)維護(hù)人類健康和預(yù)防疾病有重大意義[6, 7]。

目前國內(nèi)對(duì)香菇多糖的研究較多，對(duì)香菇蛋白質(zhì)提取研究較少。本研究通過水提法，以提取時(shí)間、料液比、提取溫度為考察因素，提取分離香菇中蛋白質(zhì)和多糖，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化提取條件，以利于充分利用香菇原料資源，促進(jìn)深加工，提高產(chǎn)品附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇干品來源于浙江慶元，粉碎過80目篩。試劑包括鹽酸、氫氧化鈉、苯酚、硫酸、無水乙醇、蒸餾水、D-無水葡萄糖保準(zhǔn)品、牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和考馬斯亮藍(lán)G-250等。儀器與設(shè)備：粉碎機(jī)、離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、紫外分光光度計(jì)和烘箱等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）水提法提取流程。稱取一定量的香菇粉末，加入一定量蒸餾水，在一定溫度下水提，3 000 r/min，離心10 min，取上清液，沉渣加入一定量的純化水進(jìn)行二次提取，3 000 r/min離心10 min，棄去沉渣，合并濾液。

（2）蛋白質(zhì)等電點(diǎn)確定。將上清液分為若干等份，配制1 mol/L鹽酸溶液，25 ℃下調(diào)pH至酸性，蛋白質(zhì)沉淀完全后，3 000 r/min離心10 min，上清液采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白質(zhì)殘留率，殘留率最低的為蛋白質(zhì)等電點(diǎn)。

（3）蛋白質(zhì)檢測(cè)。沉淀加入一定量的水溶解，于65 ℃下烘干稱重，檢測(cè)蛋白質(zhì)提取率。采用考馬斯亮藍(lán)法[8]，精確稱取100 mg的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水定容至100 mL，得到1 mg/ mL的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用移液槍分別吸取0，0.01 mL，0.02 mL，0.04 mL，0.06 mL，0.08 mL，0.10 mL于10 mL具塞試管中，加水補(bǔ)至0.10 mL，搖勻后再分別加入考馬斯亮藍(lán)G-250試劑5 mL，搖勻，放置2分鐘于595 nm下檢測(cè)吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（4）多糖檢測(cè)。合并蛋白質(zhì)沉淀后的上清液，25 ℃下用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至中性，65～70 ℃下旋蒸濃縮，加入4倍量乙醇進(jìn)行沉淀，3 000 r/min離心10 min，沉淀加入一定量水溶解，65 ℃下烘干稱重，檢測(cè)多糖提取率。采用苯酚-硫酸法[9]，精確稱取10 mg D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水定容至100 mL，得到0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于25 mL具塞試管中，加水補(bǔ)至1.0 mL，搖勻，加1 mL 5%苯酚溶液，搖勻，加5 mL 硫酸，搖勻，靜置10 min。待充分混合，30 ℃下水浴20 min，冷卻至室溫，于490 nm下檢測(cè)吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（5）單因素實(shí)驗(yàn)。在單因素實(shí)驗(yàn)中，分別考察料液比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)和多糖提取率的影響。

（6）正交實(shí)驗(yàn)。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取3個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)中的最佳實(shí)驗(yàn)條件，采用L9（33）正交設(shè)計(jì)對(duì)蛋白質(zhì)和多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)確定

用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1，靜置過夜沉淀后，離心，上清液采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見圖1。當(dāng)pH=3.7時(shí)，上清液中蛋白質(zhì)殘留量最低，說明沉淀的蛋白質(zhì)含量最多；pH在3.4～3.6之間，上清液蛋白質(zhì)殘留量相差不大；pH在3.8～4.2之間，上清液蛋白質(zhì)殘留量呈上升趨勢(shì)。因此選擇pH 3.7為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

圖1 不同pH條件下的上清液蛋白質(zhì)含量

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）料液比與蛋白質(zhì)和多糖提取率的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，在提取溫度80 ℃，提取時(shí)間3.5 h的條件下，隨料液比增大，蛋白質(zhì)和多糖提取率呈先上升后下降趨勢(shì)。料液比為20時(shí)，提取率最大，蛋白質(zhì)和多糖提取率分別為5.63%和34.86%；料液比達(dá)到30時(shí)，提取率最低，分別為5.46%和33.91%。因此，正交試驗(yàn)選取料液比范圍以20～25為宜。

表1 不同料液比下的蛋白質(zhì)和多糖提取率

（2）溫度與蛋白質(zhì)和多糖提取率的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，在料液比為20，提取時(shí)間為3.5 h的條件下，隨著提取溫度的升高，蛋白質(zhì)和多糖提取率呈現(xiàn)不斷上升趨勢(shì)，90 ℃時(shí)蛋白質(zhì)和多糖的提取率分別6.53%和35.76%；100 ℃條件下多糖提取率略有下降，但差別不明顯。綜合考慮，正交試驗(yàn)選取提取溫度的范圍以80～100 ℃為宜。

（3）提取時(shí)間與蛋白質(zhì)和多糖提取率的關(guān)系。

表2 不同溫度下蛋白質(zhì)和多糖的提取率

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，在料液比為20，提取溫度為90 ℃條件下，隨著提取時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)和多糖提取率均呈上升趨勢(shì)，提取時(shí)間4.5 h時(shí)，蛋白質(zhì)和多糖提取率均達(dá)到最大值，分別為6.58%和36.45%。綜合考慮，正交試驗(yàn)選取提取時(shí)間范圍以3.5～4.5 h為宜。

表3 不同提取時(shí)間的蛋白質(zhì)和多糖的提取率

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過分析可知，對(duì)于蛋白質(zhì)提取，提取溫度（B）對(duì)蛋白質(zhì)提取率的效果最強(qiáng)，為主要因素，提取時(shí)間（C）對(duì)提取效果最弱。實(shí)驗(yàn)表明，影響蛋白質(zhì)提取率的主次因素為B＞A＞C，提取的最優(yōu)水平組合為B3A3C3（表4、表5）。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)于多糖提取，料液比（A）的極差最大，對(duì)提取的效果最強(qiáng)，為主要因素，提取時(shí)間（C）對(duì)多糖提取的效果最弱。實(shí)驗(yàn)表明，影響多糖提取率的主次因素為A＞B＞C，多糖提取的最優(yōu)水平組合為A2B3C1。

綜合分析，兩者的最佳工藝組合為A2B3C1，即料液比為20、提取溫度為100 ℃、提取時(shí)間為3.5 h，該組合下蛋白質(zhì)提取率達(dá)6.90%，多糖提取率達(dá)38.50%。

表5 蛋白質(zhì)和多糖提取率極差分析

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過水提法同步提取分離香菇中蛋白質(zhì)和多糖，采用單因素實(shí)驗(yàn)研究料液比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)和多糖提取率的影響，并通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝條件。結(jié)果為影響蛋白質(zhì)提取率的主次因素為提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間；影響多糖提取率的主次因素為料液比＞提取溫度＞提取時(shí)間。綜合分析得兩者的最佳工藝組合為料液比20、提取溫度100 ℃、提取時(shí)間3.5 h，在此條件下蛋白質(zhì)提取率達(dá)6.90%，多糖提取率達(dá)38.50%。該工藝操作簡(jiǎn)便，成本低廉，蛋白質(zhì)和多糖提取效果顯著，能為香菇蛋白質(zhì)和多糖工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

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胡麗玲（1992—），女，學(xué)士，主要從事醫(yī)藥食品科研工作。

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2095-0934（2019）05-316-04