秦 紅 王 帥 陳昱筱 龐治華 王天元 龐全海

(山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院1，太谷 030801)(山西省柳林縣穆村鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站2，呂梁 033300)>(山西省柳林縣動物疫病預防控制中心3，呂梁 033300)

熱應(yīng)激可導致畜禽采食量、飲水量減少，生產(chǎn)性能降低，腸道菌群紊亂，消化功能失調(diào)等，給蛋雞產(chǎn)業(yè)帶來巨大損失[1]，其主要通過氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)等途徑導致機體損傷[2]。腸道是機體第一道免疫防線的重要組成部分，通過營養(yǎng)調(diào)控手段，提高腸道免疫力已成為解決熱應(yīng)激最有效的辦法。維生素C和黃芪多糖(AstragalusPolysaccharides，APS)均有緩解氧化應(yīng)激的作用[3, 4]。已有研究表明，黃芪多糖除了具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、造血、護肝以及防止動脈硬化的作用外[5]，還具有提高蛋雞生產(chǎn)性能[6]、增強疫苗免疫效價[7]、抑制腹瀉致病菌繁殖的作用[8]。維生素C是可提高動物的抗氧化性，降低氧化應(yīng)激代謝過程中所產(chǎn)生的自由基，提高生產(chǎn)性能及免疫力[9]。目前雖然已有大量黃芪多糖和維生素C單獨在飼料中的應(yīng)用研究，但主要集中于蛋雞的生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、血清抗氧化性等，對腸道免疫研究較少。本實驗以蛋雞為對象，通過在飼料中添加黃芪多糖和維生素C，研究其對蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、腸黏膜抗氧化性及相關(guān)基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

采用單因子實驗設(shè)計，144只40周齡海蘭褐蛋雞隨機分為3個處理組，每組4個重復，每個重復12只雞，對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，黃芪多糖組飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.5 g/kg黃芪多糖，維生素C組飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.2 g/kg維生素C。蛋雞置于(33±2) ℃的熱應(yīng)激環(huán)境中，預試期1周，正試期28 d，基礎(chǔ)飼糧為干粉料，參照NRC(1994)蛋雞營養(yǎng)需要配制基礎(chǔ)飼糧，飼糧組成及營養(yǎng)成分見表1。實驗采用三層階梯籠養(yǎng)，每籠3只，各重復均勻分布于雞舍，自然光與人工補光相結(jié)合，每天光照時間16 h。自由采食和飲水，每天喂料、收蛋各2次，按常規(guī)程序進行雞只免疫和欄舍消毒。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

注：維生素預混料為每千克飼料提供：維生素A 8 000 IU，維生素D 2 500 IU，維生素E 10 IU，維生素B10.8 mg，維生素B22.5 mg，維生素B61.5 mg，維生素B120.004 mg，煙酸 20 mg，葉酸 0.25 mg，泛酸鈣 18mg，生物素0.1 mg。礦物質(zhì)預混料為每千克飼料提供：Cu 8 mg，F(xiàn)e 60 mg，Mn 60 mg，Zn 80 mg，I 0.4 mg，Se 0.3 mg。營養(yǎng)水平為計算值。

1.2 實驗材料

維生素C，添加量為0.2 g/kg。

黃芪多糖，其黃芪多糖成分是總量的70%，添加量為0.5 g/kg。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 蛋雞生產(chǎn)性能

實驗期間每天定時記錄各重復產(chǎn)蛋總數(shù)、總蛋重和破蛋數(shù)，并統(tǒng)計采食量，以重復為單位每周統(tǒng)計各組產(chǎn)蛋率、平均日采食量、平均日產(chǎn)蛋量、平均蛋重和料蛋比。

1.3.2 雞蛋品質(zhì)

實驗期第28天，分別從每組隨機抽取12枚雞蛋(4枚/重復)用于測定蛋品質(zhì)指標。蛋殼強度測定儀測定蛋殼強度；蛋殼厚度測定儀測定蛋殼厚度；多功能蛋品質(zhì)分析儀測定蛋白高度、哈夫單位和蛋黃顏色。

1.3.3 腸道抗氧化能力

取十二指腸、空腸、回腸中段，測定前制備成10%的組織勻漿并吸取上清保存于-80 ℃，采用抗氧化試劑盒測定上清中總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)活性，上清液蛋白質(zhì)含量采用BCA試劑盒測定。

1.3.4 腸道形態(tài)

無菌剪取十二指腸、空腸、回腸段各0.5 cm，生理鹽水沖洗后，4%多聚甲醛進行固定，4 ℃保存24 h，自來水沖洗后經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯脫酒精，石蠟包埋后切成5 μm切片，常規(guī)HE染色，每個樣品觀察2張非連續(xù)的切片，每張切片選取5個典型的視野，用光學顯微鏡進行觀察測量，測定相應(yīng)的絨毛高度、隱窩深度以及絨毛高度與隱窩深度的比值(絨腺比)。

1.3.5 蛋雞腸道及子宮相關(guān)基因表達量的測定

采用Trizol法提取腸道及蛋殼腺組織RNA。測定RNA完整性、濃度和純度后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。以cDNA為模板, 采用熒光定量PCR技術(shù)檢測相關(guān)基因，在200 μL的PCR薄壁管中建立PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)體系20 μL，為cDNA 2.5 μL、上下引物各0.6 μL、EvaGreen 2×qPCR MasterMix 10 μL、6.3μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因β-肌動蛋白(β-actin)閾值循環(huán)(CT)，采用2-△△CT法計算樣品中各目的基因mRNA的相對表達量。引物由上海生工合成，序列見表2。

表2 引物序列信息

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

運用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(one-way-ANOVA)，以Duncan氏法進行多重比較，結(jié)果以平均值±標準誤表示，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，0.05

2 結(jié)果

2.1 黃芪多糖和維生素C對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

由表3可知，各處理組產(chǎn)蛋率、平均蛋重、日產(chǎn)蛋重、日采食量及料蛋比均差異不顯著(P>0.05)。

表3 黃芪多糖和維生素C對生產(chǎn)性能的影響

注：同行肩注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，余同。

2.2 黃芪多糖和維生素C對蛋品質(zhì)及蛋殼腺相關(guān)基因的影響

2.2.1 黃芪多糖和維生素C對蛋品質(zhì)的影響

由表4可知，與對照組相比，維生素C組蛋殼強度極顯著提高(P<0.01)，黃芪多糖組蛋殼強度顯著提高(P<0.05)。

2.2.2 黃芪多糖和維生素C對蛋殼腺相關(guān)基因的影響

如圖1所示，與對照組相比，添加維生素C后，蛋殼腺組織中CA(P<0.01)以及OP(P<0.05)mRNA的相對表達量均極顯著或顯著提高。

圖1 維生素C和黃芪多糖對蛋雞蛋殼腺相關(guān)基因的影響

2.3 黃芪多糖和維生素C對蛋雞腸道抗氧化酶活性及相關(guān)基因表達的影響

2.3.1 黃芪多糖和維生素C對蛋雞腸道抗氧化酶活性的影響

由表5可知，與對照組相比，維生素C組十二指腸、空腸、回腸MDA含量顯著降低(P<0.05)，黃芪多糖組空、回腸MDA含量顯著降低(P<0.05)。飼糧中添加維生素C極顯著提高十二指腸SOD活性(P<0.01)，添加黃芪多糖可極顯著提高十二指腸SOD活性(P<0.01)、顯著提高空、回腸SOD活性(P<0.05)。維生素C組和黃芪多糖組均極顯著提高十二指腸、空腸、回腸CAT及GSH-PX活性(P<0.01)。

表5 黃芪多糖和維生素C對蛋雞腸道抗氧化性的影響

2.3.2 黃芪多糖和維生素C對蛋雞腸道抗氧化酶相關(guān)基因表達的影響

由圖2可知，與對照組相比，維生素C顯著提高十二指腸CAT、SOD1基因相對表達量(P<0.05)，顯著提高回腸OH-1 mRNA相對表達量(P<0.05)。添加黃芪多糖可提高十二指腸(P<0.05)、空腸(P<0.01)及回腸(P<0.05)CAT基因相對表達量，提高十二指腸(P<0.01)、空腸(P<0.01)及回腸(P<0.05)組織中OH-1 mRNA相對表達量，提高十二指腸、空腸以及回腸中SOD1 mRNA相對表達量(P<0.01)。而維生素C和黃芪多糖均對SOD2 mRNA表達沒有顯著影響。

圖2 黃芪多糖和維生素C對蛋雞腸道抗氧化酶相關(guān)基因CAT、OH-1、SOD1、SOD2基因表達的影響

2.4 黃芪多糖和維生素C對蛋雞腸道形態(tài)的影響

由圖3可知，與對照組相比，添加維生素C和黃芪多糖可極顯著升高十二指腸、回腸的絨毛高度(P<0.01)，顯著升高空腸絨毛高度(P<0.01)。其中黃芪多糖極顯著降低各腸段的隱窩深度(P<0.01)，極顯著增加絨腺比(P<0.01)。維生素C組十二指腸、回腸絨腺比極顯著增加(P<0.01)。

圖3 維生素C和黃芪多糖對蛋雞腸道形態(tài)的影響

3 討論

熱應(yīng)激對蛋雞生產(chǎn)性能有較大危害，會導致蛋雞產(chǎn)蛋率、蛋重下降，其導致的采食量減少是影響蛋雞生產(chǎn)性能的主要因素之一[1]，而采食量下降會抑制功能性卵巢活動，導致卵泡生長受阻并抑制排卵物質(zhì)的分泌[10]。研究表明，黃芪多糖可顯著提高蛋雞生產(chǎn)性能，提高飼料報酬，并減緩由氧化應(yīng)激所引起的線粒體功能障礙[6, 11]。李樹文等[12]研究表明，維生素C具有提高熱應(yīng)激蛋雞采食量、產(chǎn)蛋數(shù)及產(chǎn)蛋率的作用。在本實驗中，添加黃芪多糖和維生素C后對熱應(yīng)激蛋雞的生產(chǎn)性能未見明顯影響，因此，通過檢測腸道抗氧化性、腸道形態(tài)、蛋品質(zhì)及影響蛋品質(zhì)的相關(guān)基因進一步說明其影響。

3.1 黃芪多糖和維生素C對蛋品質(zhì)及蛋殼腺相關(guān)基因的影響

蛋品質(zhì)主要由蛋白高度、蛋形指數(shù)、蛋殼強度、蛋殼厚度、哈氏單位和蛋黃顏色等指標來綜合判斷。熱應(yīng)激可降低蛋殼厚度及蛋殼強度，增加破損蛋率，影響蛋雞養(yǎng)殖效益[13]。而蛋雞飼糧中添加適量黃芪多糖和維生素C均有改善蛋品質(zhì)的作用[3, 4]。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加黃芪多糖和維生素C后其蛋殼強度分別顯著、極顯著高于對照組，與前人結(jié)果基本一致，說明黃芪多糖和維生素C有改善熱應(yīng)激蛋雞蛋殼品質(zhì)的作用。

蛋殼腺是蛋殼形成的重要部位，鈣離子轉(zhuǎn)運至殼腺腔后沉積形成蛋殼，因此蛋殼腺在鈣離子跨細胞轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用[14]。黃芪多糖和維生素C均有改善熱應(yīng)激蛋雞蛋殼品質(zhì)的作用，但其作用的具體機制未知。因此，進一步研究2種添加劑對蛋殼腺的影響，觀察其是否通過影響鈣離子的沉積進而蛋殼品質(zhì)。碳酸酐酶(CA)具有催化H2CO3分解，促進CaCO3生成的作用[15]。Ma等[16]研究表明，熱應(yīng)激可降低蛋鴨蛋殼腺中CA mRNA的相對表達量。骨橋蛋白(OPN)是一種磷酸化的細胞外基質(zhì)蛋白，在多種組織(骨、蛋殼腺等)中存在，參與Ca2+轉(zhuǎn)運，若該蛋白基因表達減少，會給蛋殼鈣化帶來缺陷[15]。飼糧中添加維生素C可提高蛋殼腺CA和OPN的相對表達量，說明維生素C通過提高CA和OPN的相對表達量進而影響蛋殼品質(zhì)。

3.2 維生素C和黃芪多糖對蛋雞腸道抗氧化能力及抗氧化基因的影響

胃腸道是生物體與腔內(nèi)容物之間的重要連接，亦是熱應(yīng)激損傷的敏感部位，熱應(yīng)激可改變機體抗氧化功能，誘發(fā)氧化脅迫，致使體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，發(fā)生氧化應(yīng)激，進而導致腸黏膜缺血缺氧性損傷，引起腸源性感染[17]。GPX、CAT、SOD活性和MDA含量是反映機體抗氧化功能的重要指標。其中，MDA是反映ROS增加的一個重要參數(shù)，ROS過量導致脂質(zhì)過氧化及氧化應(yīng)激。GPX、CAT、SOD等亦發(fā)揮著重要作用，其中SOD將超氧自由基轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，隨后GPX、CAT獨立地將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2[18]。因此，提高蛋雞腸道抗氧化酶活性，降低MDA含量，與蛋雞健康密切相關(guān)。

抗氧化酶基因表達量的增加亦是導致酶活增加的重要原因[23]。本實驗從轉(zhuǎn)錄水平考察了維生素C和黃芪多糖是否對抗氧化酶基因的表達產(chǎn)生影響。結(jié)果顯示，飼糧中添加維生素C和黃芪多糖均可不同程度地提高腸道SOD1、CAT、OH-1基因表達水平，說明維生素C和黃芪多糖均具有促進小腸SOD1、CAT、OH-1基因表達的功能，進而提高了蛋雞腸道的抗氧化性。但維生素C和黃芪多糖均對SOD2 mRNA相對表達量沒有明顯的促進作用，這可能是由于維生素C和黃芪多糖主要通過刺激SOD1影響SOD的活性。馬春陽[24]實驗結(jié)果表明抗氧化活性的提高與抗氧化基因的表達呈正相關(guān)。本實驗中，小腸組織中抗氧化性基因表達量的上調(diào)和組織中相應(yīng)酶活性的增加的結(jié)果一致，進一步驗證前人的結(jié)論。結(jié)合腸道抗氧化性能的數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖組抗氧化基因的相對表達量均高于各處理組，表明添加黃芪多糖更有力于提高蛋雞的腸道抗氧化能力。

3.3 維生素C和黃芪多糖對蛋雞腸道形態(tài)的影響

腸道是機體中重要的器官之一，在消化、吸收以及免疫防御中起著重要的作用。絨毛高度和隱窩深度可作為判斷成熟黏膜上皮細胞數(shù)量的指標，小腸絨毛高度與機體吸收能力成正相關(guān)，而隱窩深度增加導致消化功能減弱[25]。研究表明，腸道極易受到熱應(yīng)激的影響而產(chǎn)生大量自由基并通過脂質(zhì)過氧化作用損害腸道細胞結(jié)構(gòu)導致絨毛高度降低，隱窩深度變深，絨隱比降低[26]。因此，干預脂質(zhì)過氧化對維持腸道形態(tài)具有十分重要的作用，而維生素C和黃芪多糖均具有干預脂質(zhì)過氧化的作用。李世召[27]研究表明，雞胚給養(yǎng)維生素C提高了42 d肉雞十二指腸的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度。雷新宇[28]研究表明，日糧添加1%黃芪多糖顯著降低種公雞十二指腸隱窩深度，并提高空腸絨毛高度/隱窩深度比值。本實驗中，添加維生素C和黃芪多糖在一定程度上均提高腸道絨毛高度。相較于對照組，黃芪多糖更有效地降低了各腸段的隱窩深度，說明維生素C和黃芪多糖均具有維持腸道形態(tài)的作用，而添加黃芪多糖對腸道形態(tài)的作用更明顯。這可能是由于黃芪多糖除抗氧化作用外，還可通過促進緊密連接蛋白的表達調(diào)節(jié)腸上皮細胞間的通透性，更有益于腸道形態(tài)的維持[28]。

4 結(jié)論

維生素C和黃芪多糖均可通過提高腸道抗氧化基因的表達改善抗氧化能力，維持腸道的正常形態(tài)，且黃芪多糖的作用優(yōu)于維生素C。維生素C可通過提高蛋殼腺組織中CA及OP mRNA的相對表達量改善蛋殼強度。維生素C和黃芪多糖對于蛋雞的生長性能均未見明顯影響。