谷 航 陳 通 陳明杰 陸道禮 陳 斌

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013)

稻谷作為第二大谷物，全國有超過65%的人口把它作為主食，政府機(jī)構(gòu)每年都需要儲備大量大米以保障糧食供給安全，穩(wěn)定調(diào)節(jié)市場平衡，應(yīng)對自然災(zāi)害和突發(fā)事件，保證社會穩(wěn)定[1]。大米在儲藏過程中易受霉菌的侵染，使其品質(zhì)發(fā)生劣變，同時霉菌的次級代謝產(chǎn)物對人畜健康危害極大，若能在霉變早期發(fā)現(xiàn)并及時處理，將大大降低大米霉變導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。

霉變的常規(guī)理化分析方法具有操作步驟復(fù)雜、耗時長、靈敏度差等缺點，無法實現(xiàn)快速、無損的檢測需求。隨著色譜、光譜技術(shù)的不斷發(fā)展，糧食行業(yè)對霉變的辨別開始轉(zhuǎn)向針對霉菌生長代謝產(chǎn)生的物質(zhì)，如霉菌毒素、霉變揮發(fā)性有機(jī)物(Microbial Volatile Organic Compounds,MVOCs)的檢測[4]。目前檢測霉菌毒素常用的方法有薄層色譜法、高效液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)等[5-7]。這些方法大都需要樣品經(jīng)過復(fù)雜的前處理，操作繁雜、耗時久[8]。微生物揮發(fā)性有機(jī)化合物(MVOCs)指的是細(xì)菌和真菌在生長繁殖的過程中產(chǎn)生的初級或次級代謝揮發(fā)性化合物，被認(rèn)為是微生物生長的評價指標(biāo)，在臨床診斷和環(huán)境監(jiān)測中被廣泛應(yīng)用，近年正逐漸成為研究微生物污染的新型有效手段[9-10]。

氣相色譜與離子遷移譜聯(lián)用技術(shù)(GC-IMS)是近年來新出現(xiàn)的一種技術(shù)，相比電子鼻與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)，GC-IMS在揮發(fā)性有機(jī)物痕量檢測方面顯露出裝置簡單便攜、高靈敏度、無須樣品處理等的優(yōu)勢[11]。目前該技術(shù)用于食品方面的應(yīng)用研究主要集中在食用油、蜂蜜、茶葉的質(zhì)量評估等方面，而在大米霉變預(yù)測領(lǐng)域研究相對較少[12-15]。

本研究采用GC-IMS技術(shù)對霉變大米在不同霉變階段產(chǎn)生的特征性揮發(fā)性氣味物質(zhì)進(jìn)行檢測分析，遴選出用于表征霉變過程的特征指紋譜，并采用主成分分析(PCA)降維，通過聚類分析探討GC-IMS技術(shù)用于大米霉變程度的快速評定方法和進(jìn)行早期預(yù)警的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

散裝清峰大米(鎮(zhèn)江丹陽):市售。3種霉菌：黑曲霉(A)、變幻青霉(B)、寄生曲霉(C)均從霉變大米上篩選鑒定獲得。

1.2 儀器與設(shè)備

FlavourSpec 1H1-00053型氣相色譜-離子遷移譜(配CTC CombiPAL自動頂空進(jìn)樣裝置)；CLOT毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.50 μm)。

1.3 方法

1.3.1 人工霉變樣品的制備

將前期篩選鑒定過的黑曲霉、變幻青霉和寄生曲霉3種霉菌分別制備成孢子懸浮液，濃度為107～108CFU/mL。取1mL孢子懸浮液均勻噴灑至5g大米上，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱(35 ℃、90%RH)中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔4 h取樣檢測1次，以正常大米作為空白樣本，共25個樣本。

1.3.2 自然霉變樣品的制備

大米在儲藏期間容易受到霉菌的侵染，當(dāng)溫度在25～40 ℃時，黃綠青霉、黃曲霉、灰綠曲霉等開始活動，導(dǎo)致大米霉變[16]。研究選用了江蘇本地大米作為研究對象，含水率控制在14.03%左右。通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)10 g大米在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中(35 ℃、90%RH)放置3個月后霉變明顯，而最初開始的1個月基本沒有變化[17]。因此對實驗樣本的制備進(jìn)行了優(yōu)化，前期集中放樣，逐步拉長放樣時間，當(dāng)最開始的大米發(fā)生霉變即可停止放樣，集中進(jìn)行檢測，具體的實驗過程為：每次稱取本地大米10 g置于直徑60 mm培養(yǎng)皿中，標(biāo)上日期放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中(35 ℃、90%RH)，剩下的大米密封放入冰箱保存。從6月11日起開始制備樣本，前20 d連續(xù)放樣，然后每隔2、3、5、7、12 d放樣1次，各持續(xù)2次，當(dāng)最早放置的大米表面失去光澤、變黃，出現(xiàn)“起眼”、“起筋”現(xiàn)象且有明顯霉味時停止放樣，最后將放入冰箱保藏的大米作為對比樣本，共制備31個不同存放期的大米樣本并集中在同一時間內(nèi)集中檢測。

1.3.3 GC-IMS檢測條件優(yōu)化

本實驗以霉變大米為樣品進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，分析一些主要特征峰的峰強(qiáng)來選擇最優(yōu)的實驗條件。每個樣品稱取5 g于20 mL的頂空樣品瓶中，標(biāo)記后放入自動進(jìn)樣器的樣品槽中，設(shè)置儀器的相關(guān)參數(shù)后，即可開始檢測。

經(jīng)參閱資料發(fā)現(xiàn)對于不同實驗，色譜柱與漂移管溫度的變化對出峰信息量影響不大。因此，本實驗主要對孵化溫度、孵化時間、進(jìn)樣量、漂移氣和載氣的流量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在優(yōu)化某參數(shù)時，其他參數(shù)保持不變。

1.3.3.1 孵化溫度的選擇

參考已有的研究結(jié)果并考慮到孵化溫度不能超過進(jìn)樣針溫度(80 ℃)，將孵化溫度的優(yōu)化區(qū)間定為40～70 ℃。由實驗結(jié)果可知隨著溫度的上升，特征峰的強(qiáng)度都逐步增加，在60 ℃時達(dá)到頂峰；當(dāng)溫度上升到70 ℃色譜峰強(qiáng)度反而下降，主要原因為溫度過高可能會導(dǎo)致某些化合物熱分解。因此，最終選取60 ℃為最優(yōu)的孵化溫度。

1.3.3.2 孵化時間的選擇

在孵化溫度60 ℃條件下，分別將孵化時間設(shè)置為5、10、15 min后，進(jìn)行GC-IMS分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與孵化5 min相比，孵化10 min得到的特征峰的強(qiáng)度有所增加，當(dāng)孵化時間增加到15 min時，峰強(qiáng)基本不變，說明該時間點頂空氣體成分已經(jīng)達(dá)到了平衡點，不會再有新的揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生。因此，選取10 min為本研究最優(yōu)的孵化時間。

1.3.3.3 進(jìn)樣量的選擇

本研究所用儀器默認(rèn)進(jìn)樣量參數(shù)值為0.2 mL，考慮到樣本為固體，并參考已有的相關(guān)文獻(xiàn)報道，設(shè)置進(jìn)樣量的優(yōu)化區(qū)間分別為：0.2、0.5、0.8、1 mL。隨著進(jìn)樣量的增加，特征峰的強(qiáng)度逐漸增加，但是由于儀器的檢測上限過低，當(dāng)進(jìn)樣量到達(dá)0.8mL時儀器開始出現(xiàn)過飽和現(xiàn)象，因此，最佳的進(jìn)樣量為0.5 mL。

1.3.3.4 漂移氣和載氣流量的選擇

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，漂移氣流量的增加對峰值強(qiáng)度基本沒有影響，因此，采用儀器的默認(rèn)流量：150 mL/min。載氣流量的大小和穩(wěn)定性對色譜峰的分離有很大影響，GC-IMS聯(lián)用儀可以在分析過程中按一定速率提高流量，通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，相比較于恒定流速，程序控流能夠獲得更好的分離效果，因此本實驗采用程序控流，具體程序設(shè)置參照表1。

表1 儀器參數(shù)條件

1.3.4 特征峰選取

樣品的GC-IMS三維譜特征峰選取原則：GC-IMS三維譜中每個特征峰代表1種揮發(fā)性有機(jī)成分，以樣品的特征峰有無或者特征峰強(qiáng)度變化為原則，手動選擇并以長方形標(biāo)記特征峰所在區(qū)域，以該特征峰區(qū)域的峰高值(即特征區(qū)域離子強(qiáng)度的最大值)作為參數(shù)變量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析處理

GC-IMS在正離子模式下采集的三維譜數(shù)據(jù)傳輸并保存到計算機(jī)中，每張譜圖平均掃描32次，使用網(wǎng)格脈沖寬度為100 μs，重復(fù)率為21 ms，采樣頻率為150 kHz。

軟件采用 LAV2.2.1和Matlab R20R2009b進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉變大米GC-IMS譜圖分析

在GC-IMS圖譜中，不同的揮發(fā)性有機(jī)化合物在圖譜中響應(yīng)信號的位置不同。在設(shè)備檢測范圍內(nèi)，揮發(fā)性有機(jī)化合物的濃度越高，在圖譜中的信號響應(yīng)越強(qiáng)。依據(jù)特征峰選取原則，將選取的不同有機(jī)揮發(fā)性物質(zhì)對應(yīng)的特征峰區(qū)域進(jìn)行排序?qū)φ?，結(jié)果如圖所示。圖1為分別被3種不同霉菌感染的大米的檢測結(jié)果。

由圖1可知，雖然接種的霉菌種類不同，但是所對應(yīng)的特征峰的變化趨勢整體一致，如標(biāo)識號1的特征峰的強(qiáng)度與儲存時間成正比，6號特征峰強(qiáng)度先增加后減少，其他特征峰的強(qiáng)度則隨著儲存時間的增加呈現(xiàn)不同程度減弱的趨勢。通過譜庫檢索數(shù)據(jù)庫知1號特征峰為1-辛烯-3-醇、6號特征峰為正己酸的出峰，而這兩者都是霉菌產(chǎn)生的特征揮發(fā)性有機(jī)化合物[18]，而其他物質(zhì)可能是大米自身特有的氣味，隨著時間的延長濃度被逐步稀釋。選取出的部分特征峰譜庫檢索結(jié)果如表2所示。

注：橫坐標(biāo)“1～21”代表選取的特征峰標(biāo)示號，縱坐標(biāo)標(biāo)示號中A、B、C分別代表黑曲霉、變幻青霉、寄生曲霉，后綴表示培養(yǎng)時間序列。圖1 接種不同霉菌的大米在不同培養(yǎng)時間下所對應(yīng)的特征峰的圖片庫

注：橫坐標(biāo)0～84 d代表樣品的存放時間，隨著存放時間變長，霉變程度也增加，縱坐標(biāo)“1～21”代表選取的特征峰標(biāo)識號，該特征峰位置信息與圖1選取的特征峰相同。圖2 不同存放時間的大米對應(yīng)不同特征峰的圖片庫

表2 部分特征峰對應(yīng)的化合物名稱

圖2是不同存放時間的大米對應(yīng)不同特征峰的圖片庫。結(jié)合圖1與圖2可發(fā)現(xiàn)，正常大米樣品隨著存放時間的增加，1號特征峰強(qiáng)度也呈增加的趨勢，表明霉菌生長代謝產(chǎn)生的1-辛烯-3醇濃度逐步增加；6號特征峰強(qiáng)度先增加后減少，與圖1結(jié)果一致；而其他特征峰的強(qiáng)度逐步降低，表明大米自身的某些香氣物質(zhì)逐漸消失(如：庚醛、己醛[19])。隨著霉變程度的增加，營養(yǎng)物質(zhì)的流失，樣本圖譜上特征峰的數(shù)量驟減，僅存在霉變產(chǎn)物所對應(yīng)的特征峰。通過對原始圖譜中不同特征峰進(jìn)行簡單的排列比較，可以初步將自然霉變的大米樣本擬劃分為4個時期：正常大米、霉變早期、霉變中期、霉變后期[20]。

2.2 PCA分析

通過選取的不同特征區(qū)域的特征峰的組合對比排序大致可對霉變程度進(jìn)行劃分，但該劃分方法仍受限于觀察者的主觀性，無法實現(xiàn)劃分方法的數(shù)字化表達(dá)。因此，需結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法進(jìn)一步分析。以選取的特征峰對應(yīng)的峰強(qiáng)度值為特征參數(shù)變量，采用主成分分析PCA進(jìn)行降維分析。

圖3為使用PCA分析得到的第一、二主成分圖與載荷圖得分圖描述的是樣本的線性投影，代表了數(shù)據(jù)方差的主要部分[21]。結(jié)果表明，第一主成分和第二主成分的累計貢獻(xiàn)率之和達(dá)95%以上，說明第一主成分、第二主成分可以表征選取的特征峰的絕大部分信息。由圖3可知，不同霉變時期的大米樣品均有其自己的歸屬區(qū)域，表明PCA方法可以有效將大米的霉變程度進(jìn)行有效的區(qū)分。圖中霉變中期與后期相隔較近的主要原因是樣品間的放樣時間僅間隔1 d，存在一定的檢測誤差。圖3中存放74 d的樣品被劃分在霉變后期，屬于異常值，可能產(chǎn)生的原因是樣品本身帶菌量較高。

注：數(shù)字代表樣本的編號。圖3 大米樣本的主成分得分與載荷圖

數(shù)據(jù)的主成分載荷圖顯示了特征在主成分上的投影，可用于研究特征的相關(guān)性和重要程度。其中載荷圖中相應(yīng)主成分的載荷大小反映了建立模型時特征的重要性，離原點坐標(biāo)越近，特征的重要性越低。由圖3可知編號為1、4、6、7、11、13、18對應(yīng)的特征峰離原點較遠(yuǎn)，是樣品的重要表征參數(shù)。兩載荷向量的夾角是特征間相關(guān)性的描述，夾角越小，表明兩個特征之間相關(guān)性越高，即可用一個特征來表示。圖3中的1號與6號特征峰、13號與14號特征峰以及其他夾角較小的特征峰，它們之間具有較高的相關(guān)性。1與16號特征峰是逆相關(guān)的，而它們與2號特征峰相互正交，說明非相關(guān)，同理可以分析其他特征峰的相關(guān)性。載荷圖表明，前期對特征峰的選取可能不夠具有代表性，某些特征峰存在的意義不大，另一方面也可能是正常大米和早期霉變樣品品質(zhì)差異不明顯導(dǎo)致區(qū)分不明顯。選取具有代表性的特征峰主要是：1、4、7、10、11、13、17、19和21號峰。其對應(yīng)的物質(zhì)分別為：1-辛烯-3-醇、丁酸乙酯、葉醇、糠醇、正戊醇、戊醛，這些物質(zhì)可以作為判斷大米霉變程度的標(biāo)志性物質(zhì)。圖3中樣本與載荷向量的接近程度反映了該特征在建立主成分模型中的重要程度，而載荷向量的方向能有效地判斷特征的區(qū)分能力。如1、4與13號特征峰可以對霉變早期大米與霉變中后期大米進(jìn)行明顯的區(qū)分，但是正常大米與霉變早期大米間的特征變量離坐標(biāo)系原點較近，且特征兩兩之間夾角較小，相關(guān)性較高，重要程度較低，不能進(jìn)行較好的區(qū)分，霉變中期與霉變后期間特征變量較少，但僅存的兩個特征編號1和6能夠進(jìn)行一定的區(qū)分，但仍然存在歸屬區(qū)域不明確的現(xiàn)象。因此，需要進(jìn)一步采用化學(xué)計量學(xué)方法建立模型進(jìn)行判斷識別。

2.3 聚類分析

聚類分析屬于無監(jiān)督模式識別，即數(shù)據(jù)沒有類別標(biāo)記，通過某種算法(如歐氏距離)將數(shù)據(jù)歸為不同的類，基本原則是要相近的數(shù)據(jù)盡量歸為一類，而不同類之間的數(shù)據(jù)則要盡量有比較大的差別[22]。聚類算法有很多種，K-Means 是聚類算法中最常用的一種，要在聚類前指定分成的類別數(shù)。本研究采用K-Means算法將經(jīng)過PCA降維處理過的數(shù)據(jù)分為4大類：正常大米、霉變早期、霉變中期、霉變后期，結(jié)果如圖4所示。

圖4 樣本系統(tǒng)聚類分析結(jié)果

由圖4可知，存放74 d的樣品歸屬為霉變后期大米，雖然按放樣時間估計屬于霉變中期，但是其本身霉變程度達(dá)到后期，結(jié)合GC-IMS圖譜中也可以發(fā)現(xiàn)存放74 d的樣品的特征峰與霉變中期的大米的特征峰強(qiáng)度不一致，因此被判斷為霉變后期。由此可知，GC-IMS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法可以快速區(qū)分大米存儲過程中霉變過程。

3 結(jié)論

實驗采用GC-IMS技術(shù)研究了大米霉變過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)成分的變化規(guī)律，結(jié)合人工接種霉變大米的譜圖庫對自然霉變大米的霉變程度進(jìn)行了判別，初步構(gòu)建了霉變大米的GC-IMS指紋圖譜。運用化學(xué)計量學(xué)方法對其進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果表明通過GC-IMS聯(lián)用技術(shù)依據(jù)大米中揮發(fā)性有機(jī)化合物可以對霉變進(jìn)行有效的區(qū)分。得出利用GC-IMS聯(lián)用技術(shù)可用于大米霉變過程的快速鑒定與早期預(yù)警是可行的結(jié)論。