沈祥震 張紅霞 王艷麗 陳克云 孫崳林 劉艷明

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，濟(jì)南 250000)

我國是油料作物生產(chǎn)和消費(fèi)大國，近年來隨著越來越多種農(nóng)藥的發(fā)明和使用給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來方便和效益的同時(shí)，其農(nóng)藥殘留問題也日益引起人們的關(guān)注。我國雖然對(duì)大宗油料中有機(jī)磷、有機(jī)氯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留限量(0.05～0.5 mg/kg) 給出了明確規(guī)定[1]，但部分農(nóng)藥在植物油中的檢出率仍非常高。我國不同家庭經(jīng)常消費(fèi)各種食用油的比例由多到少依次為菜籽油33.5%、花生油16.8%、豆油13.5%、芝麻油10.3%、胡麻油3.8%[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合近年市場(chǎng)抽檢實(shí)際情況，選取菜籽油、花生油、大豆油3種市場(chǎng)占有份額較大的植物油為主要研究對(duì)象；以GB 2763—2016中3類植物油涉及的農(nóng)殘為基礎(chǔ)，結(jié)合農(nóng)作物種植過程中較為常用的農(nóng)藥類型，最終確定1種除草劑(氟樂靈)、2種殺菌劑(氟硅唑、腐霉利)、5種殺蟲劑(甲拌磷、七氯、樂果、倍硫磷、氯丹)共8種農(nóng)藥殘留為主要研究對(duì)象。

本實(shí)驗(yàn)采用液液萃取法對(duì)樣品中的農(nóng)藥殘留提取，選用改進(jìn)后的QuEChERS 方法進(jìn)行凈化，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立植物油中8種農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法。

目前，對(duì)于植物油的農(nóng)藥多殘留檢測(cè)前處理方法主要有液液萃取法、固相萃取法、凝膠色譜法、低溫冷凍除脂和基質(zhì)固相分散法。采用固相萃取柱可以有效去除植物油基質(zhì)、有機(jī)酸等雜質(zhì)，但存在成本較高，處理過程較為繁瑣等缺點(diǎn)；低溫冷凍除脂對(duì)冷凍溫度要求比較高且耗時(shí)、費(fèi)力達(dá)不到快速檢測(cè)的要求；凝膠色譜法去除植物油基質(zhì)最為徹底，但其高昂的設(shè)備費(fèi)用、較長的分析時(shí)間和較大的溶劑使用量等不利因素使其未能得到廣泛應(yīng)用。液-液分配法雖被作為較為常用的分離凈化方法多年但仍普遍存在回收率低，凈化不徹底，基質(zhì)干擾大等問題[3-6]。

隨著技術(shù)的發(fā)展和科技的進(jìn)步越來越多的新方法新技術(shù)被應(yīng)用到農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。如QuEChERS法，其基本原理類似基質(zhì)固相分散法，憑借其方便、快速、成本低廉的優(yōu)勢(shì)迅速得到了廣泛的應(yīng)用[7-8]。這類方法的出現(xiàn)使得農(nóng)藥多殘留檢測(cè)前處理方法變得更為簡單，但也存在著檢出限偏高、基質(zhì)干擾嚴(yán)重等問題[9]。特別是以植物油為基質(zhì)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)，常規(guī)的QuEChERS處理方法對(duì)其基體中大量脂質(zhì)的去除效果甚微，而有機(jī)氯類農(nóng)殘的高脂溶性給QuEChERS處理方法測(cè)定植物油中農(nóng)藥殘留帶來了巨大的挑戰(zhàn)。據(jù)報(bào)道C18材料中碳含量較高，屬于反向硅膠鍵合吸附劑，可以通過疏水作用，對(duì)非極性的組分和弱極性的干擾物如脂肪酸、 氨基酸、 脂肪和脂類等有較好的吸附效果，食用植物油中非極性的油脂含量最為豐富，因此C18材料對(duì)油脂的去除效果顯著。PSA材料的硅膠表面鍵合有極性官能團(tuán)，屬于弱陰離子交換吸附劑，對(duì)樣品中的一些強(qiáng)極性雜質(zhì)、有機(jī)酸、色素、糖、脂肪酸和金屬離子等具有良好的凈化效果[10-12]。故本實(shí)驗(yàn)選用C18和PSA組合對(duì)大豆油液-液萃取后的提取液進(jìn)行凈化，以基質(zhì)效應(yīng)的大小作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化比較凈化條件。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

C18粉末、PSA粉末；丙酮、乙酸乙酯、正己烷、乙腈(均為色譜純)；氟硅唑、氟樂靈、甲拌磷、七氯、樂果、倍硫磷、氯丹、腐霉利8種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(均為1 mg/mL，1 mL)；臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)；旋渦混合器；超聲提取器；7890-5977 GC/MS儀。

1.2 樣品處理

1.2.1 提取

稱取混合均勻的植物油樣品 2.00 g 于 50 mL 具塞離心管中，加入10 mL乙腈(經(jīng)正己烷飽和)，旋渦5 min，超聲提取15 min，以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心3 min，重復(fù)提取2次，合并上清液。加入10 mL 正己烷(經(jīng)乙腈飽和)，液-液分配2次，棄去正己烷層，待凈化。

1.2.2 凈化

取提取液13 mL于15 mL具塞離心管中，分別加入200 mg C18和200 mg PSA進(jìn)行基質(zhì)凈化，充分渦旋混合后，以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心3 min，準(zhǔn)確移取10 mL上清液于另一15 mL具塞離心管中，40 ℃氮吹至近干，1 mL正己烷復(fù)溶，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾, 待測(cè)定。

1.2.3 GC-MS 條件

色譜條件：色譜柱Agilent 122-3832 DB-35ms (30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱；色譜柱升溫程序：起始溫度為50 ℃，保持1 min后以30 ℃/min速率程序升溫至180 ℃，保持0 min后以3 ℃/min速率程序升溫至280 ℃，保持6 min后以10 ℃/min速率程序升溫至300 ℃，保持4 min。氦氣為載氣，純度≥99.999%，流速為 1 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：250 ℃。

質(zhì)譜條件：接口溫度：280 ℃；離子源溫度：280 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃；電子轟擊源(EI)能量：70 eV；溶劑延遲時(shí)間：5 min；數(shù)據(jù)采集模式：SIM。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的提取與凈化

在以植物油為基質(zhì)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)中，較高含量的脂質(zhì)能夠富集脂溶性較高的非極性農(nóng)藥(有機(jī)氯類農(nóng)殘)。脂質(zhì)凈化不徹底會(huì)嚴(yán)重干擾該類農(nóng)殘的回收率，所以必須采用有效的前處理手段將脂質(zhì)徹底祛除，否則不但回收率低，而且還會(huì)對(duì)分析儀器造成嚴(yán)重污染，增加維護(hù)難度，降低使用壽命。

2.1.1 提取溶劑的選擇與優(yōu)化

對(duì)于高油脂性樣品，一般采用乙腈作為提取溶劑，也有報(bào)道用乙酸乙酯和丙酮。本實(shí)驗(yàn)考察了丙酮、乙酸乙酯、乙腈3種溶劑的對(duì)提取效果的影響(圖1)。

圖1 不同提取溶劑對(duì)凈化效果的影響

乙酸乙酯、丙酮等脂溶性溶劑，提取效率比較高，但由圖1可以看出，丙酮和乙酸乙酯提取組雜質(zhì)峰的數(shù)量和基線波動(dòng)明顯高于乙腈作為溶劑的提取組。由此可以證明丙酮和乙酸乙酯能提取出大量雜質(zhì)，尤其是能將大量的油脂一并提取出來，給后續(xù)凈化工作造成困難，容易造成基質(zhì)干擾大、凈化不徹底現(xiàn)象。乙腈作為提取溶劑可以溶解的油脂量較少，提取液中的雜質(zhì)也相對(duì)較少，更有利于提取液后續(xù)凈化，更適合于植物油中多農(nóng)藥殘留的提取。

本實(shí)驗(yàn)還考察了使用相同體積的乙腈，比較提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響

經(jīng)方法一提取的實(shí)驗(yàn)組中氟硅唑、氟樂靈、甲拌磷、倍硫磷、腐霉利、樂果的回收率均小于75%，經(jīng)方法二和方法三提取的實(shí)驗(yàn)組中，除氯丹和七氯2種有機(jī)氯類農(nóng)藥以外其他6種農(nóng)殘的回收率均在80%～110%之間，其回收率和RSD均能滿足SANCO/12571/2013歐盟DG SANCO的要求。方法三在提取效果方面雖然能略高于方法二，但綜合考慮到實(shí)驗(yàn)的簡便性和回收率的可接受性后本實(shí)驗(yàn)最終采用提取方法二分2次進(jìn)行提取。

2.1.2 凈化方法的選擇與優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用液-液萃取結(jié)合QuEChERS固相凈化法，通過選擇合適的凈化劑以吸附液-液萃取后剩余的微量脂質(zhì)，以期達(dá)到最大程度凈化樣品的目的。通過比較8種農(nóng)殘?jiān)谟袡C(jī)溶劑中的溶解度可以發(fā)現(xiàn)，8類農(nóng)藥的溶解度隨極性降低而減小。因此，本實(shí)驗(yàn)選用極性較小的正己烷(經(jīng)乙腈飽和)進(jìn)行液-液分配，不僅能祛除脂質(zhì)而且不會(huì)因溶劑間溶解度的差異造成待測(cè)組分的損失。本實(shí)驗(yàn)還比較了不同分配次數(shù)和萃取體積對(duì)油脂去除效果的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同分配次數(shù)和萃取體積對(duì)油脂去除效果的影響

采用正己烷液-液分配法雖能逐次降低脂肪含量得到較為理想的凈化效果，但提取液中仍會(huì)有微量脂質(zhì)殘留，經(jīng)濃縮后脂質(zhì)殘留現(xiàn)象更為明顯。故本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)合QuEChERS方法，通過選擇合適的凈化劑以徹底清除提取液中殘余的脂質(zhì)。

2.1.3 凈化劑的選擇與優(yōu)化

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中的某些雜質(zhì)組分經(jīng)提取后進(jìn)入分析單元干擾待測(cè)物的分析過程，影響待測(cè)物濃度測(cè)定的準(zhǔn)確性，一般為基質(zhì)抑制或基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[13]。在采用純?nèi)軇┡渲频臉?biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量時(shí)發(fā)現(xiàn)本研究所選擇的8種常見農(nóng)藥均為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用正己烷和經(jīng)不同凈化方式處理后空白花生油樣品提取液，分別配制8種農(nóng)藥的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液；利用不同處理方法的基質(zhì)標(biāo)目標(biāo)響應(yīng)和溶劑標(biāo)目標(biāo)響應(yīng)兩者的比值(K)來評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)的影響，(K)值越小表明基質(zhì)效應(yīng)越小，樣品凈化越徹底。結(jié)果見圖4。

圖4 不同凈化方式對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響

從圖4中可以看出， 當(dāng)凈化劑用量為200 mg時(shí)，其基質(zhì)效應(yīng)與400 mg組無明顯差異，且提取液澄清透明，故本實(shí)驗(yàn)選用200 mg C18+200 mg PSA組合對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化。

2.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)

將標(biāo)準(zhǔn)加入水平定為0.02、0.04、0.1和0.2 mg/kg，按上述方法對(duì)大豆油進(jìn)行檢測(cè)，平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率和RSD，從表1可見，大豆油樣品中8種目標(biāo)分析物的檢出限(LOD，S/N=3)為0.004～0.015 mg/kg，定量限(LOQ，S/N=10)為0.014～0.026 mg/kg，回收率為71.9%～113%，RSD為3.4%～13.4%，回收率范圍均能滿足GB/T 27404—2008的要求[14]。

表1 8種農(nóng)藥的檢出限、定量限、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.3 實(shí)際樣品測(cè)定

從本地市場(chǎng)隨機(jī)抽取花生油、大豆油、菜籽油各2份，在最優(yōu)條件下處理后進(jìn)行GC-MS分析。結(jié)果顯示，6份植物油樣品中僅1例花生油檢出腐霉利， 檢出值為0.12 mg /kg，未超過GB 2763—2016規(guī)定的0.5 mg/kg最大殘留限量值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用QuEChERS方法對(duì)植物油樣品前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)合GC-MS建立了一套可同時(shí)測(cè)定植物油中8種中常見農(nóng)藥的快速檢測(cè)方法，檢出限、定量限、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均能滿足農(nóng)藥多殘留檢測(cè)方法的要求。采用液-液萃取技術(shù)結(jié)合QuEChERS法的好處在于QuEChERS前處理方法彌補(bǔ)了液-液萃取法去干擾物質(zhì)不徹底的缺陷，提高了方法的靈敏度和結(jié)果的準(zhǔn)確性; 另一方面，采用QuEChERS法進(jìn)行樣品前處理，大大縮短了前處理時(shí)間周期，達(dá)到了應(yīng)急檢驗(yàn)快速分析的工作目的。