周華妙 郭 勇

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

乳腺癌是嚴(yán)重威脅全球女性健康的疾病之一，我國(guó)女性乳腺癌發(fā)病人數(shù)約24.9萬,發(fā)病率37.86/10萬，在近10年發(fā)病呈上升趨勢(shì)[1]，但乳腺癌的總體生存狀況明顯好于其他常見惡性腫瘤，我國(guó)女性乳腺癌患者的5年生存率估計(jì)為73%，條件較好的大城市可達(dá)80%，而影響其死亡的仍然是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。乳腺癌在中醫(yī)學(xué)中多屬于“乳巖”“乳石癰”，由于情志失調(diào)，肝氣郁結(jié)或因沖任失調(diào)，氣血運(yùn)行不暢，氣滯血瘀，熱毒結(jié)滯于乳中而發(fā)病。而清熱解毒法是中醫(yī)治療腫瘤的常用治法之一，并在長(zhǎng)期的臨床治療中獲得了一定的療效[2]，但是其作用機(jī)制報(bào)道不多。本次實(shí)驗(yàn)中建立乳腺癌4T1細(xì)胞荷瘤小鼠模型，選用黃連解毒湯進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞侵襲遷移能力，探尋對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的影響及一些可能的相關(guān)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物：8周齡Balb/c小鼠，體重為18±2g，SPF級(jí)飼養(yǎng)；浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心喂養(yǎng)（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)：0238458；0238459）。

1.2 細(xì)胞株：小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞株由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞房提供。

1.3 主要試劑與儀器：黃連解毒湯由浙江省中醫(yī)院中藥房熬制并于浙江中醫(yī)藥大學(xué)制劑中心濃煎后滅菌封裝備用。灌胃工具由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供?；|(zhì)膠（BD-P 253234），Transwe11小室（Corning），PBS（1×）（凱基），DMEM高糖培養(yǎng)基（1×）（吉諾），1640培養(yǎng)基（1×）（含雙抗）（凱基），胎牛血清（四季青），0.25%胰酶-EDTA（吉諾），BSA(MULTICELL)，結(jié)晶紫（達(dá)文），移液槍（eppendorf），離心機(jī)（Thermo），熒光倒置顯微鏡（Zeiss），高壓滅菌箱（SANYO）等。

1.4 試驗(yàn)方法與步驟：將20只8周齡雌性Balb/c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為2組，每組10只，即單純荷瘤組、清熱解毒組。于單純荷瘤組、清熱解毒組小鼠乳腺脂肪墊接種小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞，接種后24h給藥：?jiǎn)渭兒闪鼋M：以飲用水灌胃，每日0.2ml/10g；清熱解毒組：以黃連解毒湯灌胃，每日0.2ml/10g。持續(xù)用藥35天，黃連解毒湯組成：黃芩、梔子各9g，黃連、黃柏各6g。湯劑由浙江省中醫(yī)院中藥房熬制并于浙江中醫(yī)藥大學(xué)制劑中心濃煎后滅菌封裝備用。

1.5 瘤體及其他組織標(biāo)本：第35天于超凈臺(tái)解剖各組小鼠，以無菌眼科剪、手術(shù)刀片打開小鼠胸腔、腹腔并開顱，行大體觀察，剝離出瘤體，做記錄，稱重，拍照。對(duì)瘤體處理：①進(jìn)行Tanswell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)；②進(jìn)行流式細(xì)胞分析；③取出小鼠右側(cè)肺臟于電子天平中稱重，脫水、包埋，常規(guī)石蠟切片，進(jìn)行HE染色計(jì)數(shù)右肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)灶。

1.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：①Transwell小室制備：用50mg/L基質(zhì)膠1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50μl含10g/L BSA的無血清培養(yǎng)液，37℃，30min。②制備細(xì)胞懸液：小鼠乳腺原位接種后24d，行頸椎脫臼法處死，選擇單純荷瘤組、清熱解毒組乳腺原位瘤體組織，取出后采用組織塊接種法移植回培養(yǎng)瓶中，予含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基行體外培養(yǎng)，3天后移去小瘤塊，換液后繼續(xù)培養(yǎng)以擴(kuò)大細(xì)胞總量。將瓶中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（密度70%～80%）用0.25%胰酶-EDTA消化，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105～5×105。③接種培養(yǎng)細(xì)胞：細(xì)胞懸液（100～200μl）加入Transwell小室，常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)。④結(jié)果統(tǒng)計(jì)：用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，采用0.1%結(jié)晶紫進(jìn)行細(xì)胞染色，顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照，取10個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.7 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：①Transwell小室每孔加入50μl含10g/L BSA的無血清培養(yǎng)液，37℃，30min。②制備細(xì)胞懸液：小鼠乳腺原位接種后24d，行頸椎脫臼法處死，選擇單純荷瘤組、清熱解毒組乳腺原位瘤體組織，取出后采用組織塊接種法移植回培養(yǎng)瓶中，予含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基行體外培養(yǎng)，3天后移去小瘤塊，換液后繼續(xù)培養(yǎng)以擴(kuò)大細(xì)胞總量。將瓶中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（密度70%～80%）用0.25%胰酶-EDTA消化，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105～5×105。③接種培養(yǎng)細(xì)胞：細(xì)胞懸液（100～200μl）加入Transwell小室，常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)。④用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，采用0.1%結(jié)晶紫進(jìn)行細(xì)胞染色，顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照，取10個(gè)視野統(tǒng)計(jì)細(xì)胞遷移面積，并計(jì)算遷移面積百分比。取平均數(shù)作為遷移面積百分比結(jié)果，進(jìn)行整理及統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 流式細(xì)胞分析術(shù)：將新鮮腫瘤提取巨噬細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)，使用BD FACSCantoⅡ進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，根據(jù)抗體與檢測(cè)通道“強(qiáng)弱搭配”原則，抗體F4/80使用FITC通道，CD206使用APC通道，iNOS使用PE通道，先用單抗體染色樣本選定陽(yáng)性區(qū)域，以FITC、PE通道雙陽(yáng)性表示M1型巨噬細(xì)胞，以FITC、APC通道雙陽(yáng)性表示M2型巨噬細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，分別計(jì)算其在樣本細(xì)胞中的陽(yáng)性率，并將陽(yáng)性率結(jié)果進(jìn)行整理及統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。統(tǒng)計(jì)描述：計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。統(tǒng)計(jì)推斷：兩組間均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)分析，均以P＜0.05為差異顯著的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察肺臟轉(zhuǎn)移情況：見圖1。兩組小鼠肺組織表面凹凸不平，可見散在透亮的類圓形結(jié)節(jié)灶。肺組織HE染色，各組小鼠肺組織中均可見明顯的團(tuán)狀腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，伴有大量異形核細(xì)胞增生，大量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。低倍鏡（100×）下觀察并隨機(jī)取4個(gè)視野計(jì)數(shù)小鼠右肺轉(zhuǎn)移灶。結(jié)果顯示，單純荷瘤組3.5±1.29個(gè)小鼠肺部轉(zhuǎn)移灶，清熱解毒組2.7±0.96個(gè)，與單純荷瘤組相比較少，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 小鼠肺部轉(zhuǎn)移灶HE染色

2.2 Transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)觀察腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力：見圖2、圖3。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果：清熱解毒組穿透Transwell膜的細(xì)胞數(shù)量268.4±11.23，比單純荷瘤組（285.7±13.55）有所減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果：清熱解毒組遷移面積百分比（66.76±7.46）%與單純荷瘤組（72.3±2.83）%相比有所減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

圖3 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞：見圖4?？贵wF4/80使用FITC通道，iNOS使用PE通道，CD206使用APC通道，以F4/80(+)iNOS(+)代表M1型巨噬細(xì)胞，F(xiàn)4/80(+)CD206(+)代表M2型巨噬細(xì)胞。結(jié)果如下：M1型巨噬細(xì)胞：?jiǎn)渭兒闪鼋M中M1型巨噬細(xì)胞含量較低（1.8±0.10）%，清熱解毒組中M1型巨噬細(xì)胞含量（2.3±0.20）%與單純荷瘤組相比較多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；M2型巨噬細(xì)胞：清熱解毒組中M2型巨噬細(xì)胞含量較高（36.3±3.70）%，與單純荷瘤組（21.5±1.50）%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖4 流式細(xì)胞分析

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是一系列復(fù)雜的、多步驟、多因素相互作用的連續(xù)過程，由原發(fā)瘤發(fā)展成為侵襲性腫瘤，腫瘤細(xì)胞侵襲基底膜，并進(jìn)入淋巴系統(tǒng)與血液循環(huán)，形成瘤栓，進(jìn)入并穿出靶器官微血管，形成轉(zhuǎn)移灶[3]。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的黃連解毒湯干預(yù)荷瘤小鼠，該方具有抗菌、抗內(nèi)毒素、解熱鎮(zhèn)痛、抗腫瘤作用等諸多藥理作用[4]，可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[5]。其有效成分漢黃芩素可明顯抑制腫瘤細(xì)胞分裂和集落形成能力，從而抑制其增殖，同時(shí)，可通過啟動(dòng)線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[6]。在腫瘤組織中，TAMs通常被定向極化為具有免疫抑制作用的M2型巨噬細(xì)胞，直接抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL細(xì)胞）和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）對(duì)腫瘤的殺傷作用[7-10]。研究發(fā)現(xiàn)[11]，荷瘤小鼠經(jīng)黃連解毒湯干預(yù)后，腫瘤組織新生微血管數(shù)目減少，故其控制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用可能與抗腫瘤血管生成有關(guān)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腫瘤其證多屬本虛標(biāo)實(shí)，而“女子乳頭屬肝，乳房屬胃”，若肝失疏泄，氣機(jī)郁滯，或脾胃運(yùn)化失司，濕熱蘊(yùn)結(jié)，則易乳絡(luò)閉阻，氣血熱毒瘀滯，發(fā)生病變。黃連解毒湯以清熱解毒為法，清解蘊(yùn)結(jié)之熱毒，化邪去毒，是治療乳腺癌的主要治法之一。本實(shí)驗(yàn)中觀察到黃連解毒湯干預(yù)后，荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力產(chǎn)生了一定的抑制，筆者推測(cè)通過清熱解毒減弱了腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移，另外，荷瘤小鼠的肺轉(zhuǎn)移灶有減少趨勢(shì)，而流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M1型、M2型均有增加，故推測(cè)黃連解毒湯一定程度抑制腫瘤侵襲遷移，從而達(dá)到控制腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，可能并非主要通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中M1以改善免疫微環(huán)境來抑制腫瘤發(fā)展，這與中醫(yī)理論中清熱解毒以祛邪為主相統(tǒng)一。但因考慮到小鼠辨證論治的困難度，因此在實(shí)驗(yàn)中未進(jìn)行辨證論治，存在一定的局限性，以及進(jìn)一步的可能機(jī)制有待繼續(xù)探討和研究。