姜雪萍，陳艷君，朱富成，王芳，孫傳伯，趙群

（皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽六安 237012）

中藥百合為百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）植物卷丹（Lilium lancifolium）、百合（L.brownii）或細(xì)葉百合（L.pumilum）的干燥肉質(zhì)鱗葉，為我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥，具有藥、食兩用功能，有“蔬菜人參”的稱號(hào)[1-4]。因此，以上3種植物是中藥百合的基源植物。研究表明，百合中含有的多糖等成分具有保健和治療作用[5]。多糖能夠清除羥自由基，阻礙癌細(xì)胞繁殖和生長(zhǎng)[6-8]。百合具有清心安神和養(yǎng)陰潤(rùn)肺的功能，主要用于治療陰虛燥咳，勞嗽咳血，失眠多夢(mèng)和精神恍惚等病癥[9]。由于百合具有藥食兩用價(jià)值，僅僅靠野生資源已經(jīng)難以滿足日益增長(zhǎng)的需求[10]。同時(shí)，百合在市場(chǎng)上價(jià)格較高[11]，一些不法商家用其他廉價(jià)的淀粉冒充百合粉。因此，有必要對(duì)百合的真?zhèn)芜M(jìn)行有效鑒別。

目前，主要通過(guò)薄層色譜法、顯微觀察結(jié)構(gòu)法等對(duì)百合的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒定[4，12-13]。然而，以上方法有的對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求較高，操作繁瑣，成本高；有的需要較高的專業(yè)知識(shí)，因此不能滿足百合真?zhèn)慰焖俣行цb定的要求。DNA條形碼作為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的一種新的分子標(biāo)記技術(shù)，操作起來(lái)比較簡(jiǎn)便，材料用量少，結(jié)果可信度高，能夠?qū)ξ锓N進(jìn)行快速而有效的鑒定[14-16]。該研究以ITS序列為DNA條形碼，研究鑒別中藥百合及其混偽品的DNA條形碼鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的GenBank獲取用來(lái)構(gòu)建百合及其混偽品系統(tǒng)發(fā)育樹的內(nèi)群和外群的ITS序列。

以老鴉瓣（Amana edulis）的1條ITS序列為外群，百合正品基源植物和相關(guān)混偽品的ITS序列為內(nèi)群。正品百合的基源植物來(lái)源于3個(gè)物種，分別為百合科植物卷丹（L.lancifolium）、百合 （L.browniivar.viridulum）和細(xì)葉百合（L.pumilum）（表 1）。

表 1 百合藥材及其混偽品ITS序列及GenBank登錄號(hào)

1.2 方法

1.2.1 序列分析。用軟件Clustal X 1.81對(duì)從GenBank下載的百合、混偽品及外群的ITS部分DNA序列進(jìn)行比對(duì)和排序，再用軟件BioEdit 7.0.9.0[17]進(jìn)行編輯。用MEGA 4.0軟件[18]統(tǒng)計(jì)所有序列的變異位點(diǎn)并按Kimura雙參數(shù)法統(tǒng)計(jì)所有序列的核苷酸組成，計(jì)算種內(nèi)和種間的遺傳距離。

1.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。以正品和混偽品的ITS部分DNA序列為分子標(biāo)記，分別用貝葉斯法（Bayesian inference，BI）和簡(jiǎn)約法（Maximum parsimony，MP）構(gòu)建2種系統(tǒng)發(fā)育樹。分別用MrBayes 3.1.2軟件[19]和PAUP*4.0 beta 10軟件[20]構(gòu)建BI樹和MP樹。在構(gòu)建BI樹時(shí)，用MrModeltest 2.3軟件[21]根據(jù)AIC（Akaike Information Criterion）檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)選擇最優(yōu)數(shù)據(jù)模型（GTR+G）。馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法（MCMC）設(shè)置為每條鏈運(yùn)轉(zhuǎn)800 000次。MCMC分別運(yùn)轉(zhuǎn)2次以便確定其收斂。每100棵樹抽取1個(gè)樣本，共形成16 002棵樹的樣本。整個(gè)系統(tǒng)運(yùn)行30 000代后得到的發(fā)育樹趨于穩(wěn)定，用剩余的15 402個(gè)樣本建樹并且估計(jì)其后驗(yàn)概率（Posterior probability，PP）值。構(gòu)建MP樹時(shí)，設(shè)置自舉重復(fù)次數(shù)（bootstrap nreps）為1 000次，設(shè)置啟發(fā)式搜索為由隨機(jī)逐步添加法產(chǎn)生起始樹，重復(fù)10次，采用TBR分支交換。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

正品和混偽品的ITS序列經(jīng)Clustal X 1.81軟件比對(duì)后，得到的序列長(zhǎng)度為610 bp（包括Gaps），共有266個(gè)變異位點(diǎn)，其中包含110個(gè)簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)（parsimony-informative characters）。所有序列的平均G+C含量為60.1%，百合藥材所有基源植物的平均G+C含量為60.5%，百合ITS序列的G+C含量和所有植物種類幾乎沒(méi)有差異。百合藥材的3個(gè)正品基源植物百合、細(xì)葉百合和卷丹的種內(nèi)平均遺傳距離分別為0.014、0.106和0.000，而相應(yīng)各正品基源植物與混偽品之間的平均遺傳距離分別為0.077、0.115和0.057。百合藥材3個(gè)正品基源植物種間平均遺傳距離分別小于其與混偽品之間的遺傳距離。

2.2 百合和混偽品之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

由圖1可知，用BI法和MP法構(gòu)建的2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹主干基本一致。各譜系分支的節(jié)點(diǎn)處標(biāo)有BI樹的后驗(yàn)概率值和MP樹的自舉支持度（Bootstrap，BS）。在2種系統(tǒng)發(fā)育樹中，百合藥材的3個(gè)正品基源植物所有ITS序列的單倍型分別以較高的支持度聚類為單獨(dú)的譜系分支，其中百合分支的支持度為PP＝1.00 和BS＝99，細(xì)葉百合的支持度為PP＝0.99 和BS＝92，卷丹的支持度為PP＝0.99 和BS＝71。而其他混偽品都與以上3種正品百合基源植物的差異明顯，各自聚類于其他的分支，并不和百合藥材的正品基源植物聚類在一起。

圖1 基于ITS序列單倍型貝葉斯分析法重建的百合及其混偽品之間的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

百合藥材的3個(gè)正品基源植物百合、細(xì)葉百合和卷丹的種內(nèi)平均遺傳距離分別小于各自與混偽品之間的平均遺傳距離。所以，DNA的ITS序列可以用作分子標(biāo)記鑒定百合藥材以及混偽品。由于在ITS序列中，正品百合與其混偽品之間存在特異性堿基位點(diǎn)，可以設(shè)計(jì)百合的特異性鑒別引物用于百合藥材的快速PCR鑒定。目前，已經(jīng)有部分中藥材能夠通過(guò)特異性PCR來(lái)進(jìn)行快速鑒定[22-27]。

由于百合藥材的3個(gè)正品基源植物的單倍型在系統(tǒng)發(fā)育樹中各自聚類為單系，所以通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，可以將3個(gè)正品百合的基源植物分別與混偽品區(qū)別開(kāi)，從而達(dá)到鑒別正品百合的目的。在進(jìn)行鑒別的時(shí)候，采用的方法是先測(cè)得待測(cè)樣品的ITS序列，再將該序列同以上系統(tǒng)樹中的所有正品與混偽品的ITS序列進(jìn)行比對(duì)。檢查待測(cè)樣品與已知正品和混偽品之間的遺傳距離并構(gòu)建BI和MP 2種系統(tǒng)發(fā)育樹。若待測(cè)樣品和已知正品的遺傳距離小于與混偽品的遺傳距離，并且在系統(tǒng)發(fā)育樹中以極高的支持度和正品序列聚類在一起，則可以表示待測(cè)的樣品為正品，反之，即為混偽品。