吳玲玲　高宏君　蔣鵬　武楨　周杰彬

【摘? 要】目的：利用網(wǎng)絡(luò)藥理學探討鹿茸治療腎細胞癌的作用機理。方法：通過網(wǎng)絡(luò)藥理學分析平臺（BATMAN-TCM）數(shù)據(jù)庫篩選鹿茸所對應(yīng)的靶標基因，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選腎細胞癌的靶標基因，通過Venny2.1數(shù)據(jù)庫獲得鹿茸對腎細胞癌的相關(guān)靶點，利用STRING數(shù)據(jù)庫進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，利用 David6.8數(shù)據(jù)庫進行GO分析和KEGG信號通路富集分析。結(jié)果：從鹿茸中篩選獲得包括17-β-雌二醇、氨基葡萄糖、三磷酸腺苷、視黃醇等14 個化學成分及 303 個靶點。鹿茸作用于腎細胞癌的靶點有20個，主要靶點包括連環(huán)蛋白β1、轉(zhuǎn)化生長因子β1、腫瘤壞死因子、干擾素γ、雌激素受體1、基質(zhì)金屬蛋白酶9、趨化因子受體等。利用 David6.8數(shù)據(jù)庫進行GO分析得到143個生物學過程，13個細胞組成，26個分子功能，通過 KEGG 分析富集得到34條通路。結(jié)論： 本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學分析得出鹿茸的有效化學成分，初步預測了鹿茸作用于腎細胞癌的靶點并初步揭示了鹿茸對腎細胞癌的作用機制，為腎細胞癌的治療提供了更多可能。

【關(guān)鍵詞】鹿茸;腎細胞癌;網(wǎng)絡(luò)藥理學;作用機理

【中圖分類號】R29 ?????【文獻標志碼】A ?????【文章編號】1004-7484（2020）09-0268-02

腎細胞癌是起源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，又稱腎癌、腺癌，大多數(shù)腎癌是透明細胞癌。腎細胞癌是腎臟最為常見的腫瘤，約占腎腫瘤總數(shù)的75%-80%，約占全部成人惡性腫瘤的2% ～3%，發(fā)病年齡多在40-60歲。腎細胞癌發(fā)展到晚期，會轉(zhuǎn)移至肺部及骨骼。

鹿茸是一種名貴的中藥材，其表面覆蓋毛發(fā)，內(nèi)部由結(jié)締組織、軟骨、血管與大量神經(jīng)纖維組成。鹿茸首于 《神農(nóng)本草經(jīng)》 ，列為中品，其性溫，味甘、咸，歸肝、腎經(jīng)，具有壯腎陽、益精血、強筋骨等功效。鹿茸是唯一能夠完全再生的哺乳動物組織?！侗静菥V目》記載，鹿茸具有治療腎陽不足、精血虧虛、陽痿滑精、宮冷不孕、神疲、畏寒、眩暈、耳鳴、耳聾、等功效。中藥成分具有“多成分、多靶點”的特點，而網(wǎng)絡(luò)藥理學研究藥物系統(tǒng)性、整體性的特點，與中醫(yī)藥辨證論治的原則不謀而合。

1.材料

STRING數(shù)據(jù)庫、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫、GeneCards 、Venny2.1工具、David 6.8數(shù)據(jù)庫、GraphPad Prism 7.0 軟件、OmicShare數(shù)據(jù)庫等。

2.方法

2.1鹿茸的化學成分收集與靶點預測

利用中藥分子機制生物信息學分析平臺BATMAN-TCM 挖掘鹿茸的化學成分，通過該服務(wù)器的 “成分-靶點相似性”原理，設(shè)置閥值 “Score cutoff =30”，計算化學成分對應(yīng)的潛在靶點。

2.2腎細胞癌潛在作用靶點的篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，檢索腎細胞癌相關(guān)靶點，輸入“renal cell carcinoma”，按“Relevance score”排序取前200 個靶點作為腎細胞癌疾病的候選靶點。

2.3鹿茸靶點與腎細胞癌靶點關(guān)聯(lián)分析

利用Venny2.1工具將鹿茸的化學成分靶點導入到“List1”，將腎細胞癌相關(guān)靶點導入到“List2”中進行交集比對，最終獲得鹿茸對腎細胞癌的相關(guān)靶點。

2.4靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫平臺構(gòu)建靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”進行操作，將最低相互作用閥值設(shè)為中等“medium confidence = 0. 4 ”。

2.5 GO生物過程富集

在David 6.8數(shù)據(jù)庫中，依次選擇 “OFFICIAL-GENE-SYMBOL”、“Gene list”、“Submit list”，修改背景為“人類”，選擇“Gene Ontology”，分別勾選“生物過程” 、“分子功能 ”、“細胞成分” ，將得到的數(shù)據(jù)導入GraphPad Prism 7.0 軟件進行GO分析，得到鹿茸對腎細胞癌作用靶點的GO分析結(jié)果。

2.6 KEGG信號通路分析

在David6.8數(shù)據(jù)庫中，依次選擇“OFFICIAL-GENE-SYMBOL”、“Gene list”、“Submit list”，修改背景為“人類”，選擇“Pathway-KEGG”，將得到的數(shù)據(jù)導入到OmicShare數(shù)據(jù)庫中進行KEGG分析，得到鹿茸對腎細胞癌作用靶點的KEGG分析的氣泡圖。

3.結(jié)果分析

3.1鹿茸的化學成分收集與靶點預測

利用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫共挖掘到鹿茸有效化學成分14個（如表1），對應(yīng)的潛在靶點363個，經(jīng)刪除重復項后得到303個潛在靶點，其中包括ABAT、BCL3、COX1、DAO、ESR1、FABP6等。

3.2腎細胞癌相關(guān)靶點的篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，檢索腎細胞癌相關(guān)靶點，輸入“renal cell carcinoma”共得到7776個相關(guān)基因，按“Relevance score”排序取前200 個靶點作為腎細胞癌疾病的候選靶點，見表2（僅列出relevance score前10 個）。

3.3鹿茸靶點與腎細胞癌靶點關(guān)聯(lián)分析

利用Venny 2.1工具將鹿茸靶點與腎細胞癌靶點關(guān)聯(lián)分析，最終獲得20相交靶點，包括CTNNB1、TGFB1、TNF、 IFNG 、ESR1 、SLC2A1 、MMP9 、CXCR4等。

3.4靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析

將鹿茸靶點與腎細胞癌靶點關(guān)聯(lián)分析獲得的20個相交靶點導入到STRING數(shù)據(jù)庫中，獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，并得出各靶點間相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果如圖1所示。其中“節(jié)點”代表作用靶點，“邊”代表各靶點之間的相互關(guān)聯(lián)，其“粗細”用“combine score” 表示，邊越粗，combine score值越大，代表其結(jié)合度越大。由圖可知，共有20個節(jié)點、83條邊，平均節(jié)點度為8.3，平均局部聚類系數(shù)為0.744。

3.5 GO生物過程富集

利用 David 6.8數(shù)據(jù)庫將鹿茸作用于腎細胞癌的20個靶點進行 GO 分析，從生物學過程、細胞組成、分子功能對20個關(guān)鍵靶點進行分類分析，分別得到170、16、33條，P<0. 05 者分別為143、13、26 條。其中生物學過程包括藥物反應(yīng)、一氧化氮生物合成的正調(diào)節(jié)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的負調(diào)節(jié);細胞組成包括等離子體膜、細胞表面、蛋白質(zhì)復合體、細胞外區(qū)域等;分子功能包括酶結(jié)合、類固醇激素受體的活動、類固醇結(jié)合、相同的蛋白結(jié)合等。

3.6 KEGG 信號通路分析

利用 David 數(shù)據(jù)庫進行KEGG信號通路富集，共得到42條信號通路，P<0.05 者有34條，其中包括癌癥通路、腎細胞癌、破骨細胞分化、MAPK信號通路、癌蛋白聚糖等。

4.討論

本文通過對鹿茸“成分-關(guān)鍵靶點-通路”的網(wǎng)絡(luò)進行分析，發(fā)現(xiàn)了鹿茸 14 個化學成分及303個潛在靶點，將鹿茸靶點與糖尿病腎病靶點進行關(guān)聯(lián)性分析得到20個相交靶點。已有文獻表明，三磷酸腺苷在抗人食管癌細胞增殖方面有較強的作用，LRAT和RDH12是視黃醇代謝相關(guān)基因，對宮頸鱗癌細胞具有抑制效果，氨基葡萄糖具有抗腫瘤和增強免疫的功能。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，推測鹿茸可能通過作用于視黃醇X受體RXRA從而影響癌癥信號通路發(fā)揮藥效。故三磷酸腺苷、視黃醇和氨基葡萄糖可能是鹿茸潛在的抗腫瘤成分，并通過癌癥通路等信號通路發(fā)揮抗腫瘤的作用。研究發(fā)現(xiàn)17-β-雌二醇對MHCC97H肝癌細胞的侵襲具有有效的抑制作用;研究表明注射前列腺素E17d對腫瘤有抑制作用。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示鹿茸中17-β-雌二醇、前列腺素E1能夠作用到ESR1、ESR2關(guān)鍵靶點，推測鹿茸可能通過作用于這些靶點從而影響癌蛋白多糖等信號通路發(fā)揮藥效。綜合文獻及網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，證明鹿茸在治療腫瘤疾病方面具有潛在的優(yōu)勢。然后，對鹿茸作用于腎癌的主要的20個靶點進行DAVID分析得到生物學過程、細胞組成、分子功能等相關(guān)信息。

P<0.05 的生物過程有143個，包括藥物反應(yīng)、一氧化氮生物合成的正調(diào)節(jié)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的負調(diào)節(jié)等。主要涉及氧化應(yīng)激、抗炎、抗氧化等方面。有研究表明，經(jīng)高鎂培養(yǎng)基培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞中NO產(chǎn)生增加，可防止NF-κB活化，降低基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）活性。研究表明，MMP-9蛋白的表達對腫瘤的分化程度、侵襲與轉(zhuǎn)移有影響，故推測一氧化氮生物合成的正調(diào)節(jié)與腎癌的方式密切相關(guān)。P<0.05 的分子功能有26個，包括蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、類固醇結(jié)合等。蛋白結(jié)合是指藥物進入血液循環(huán)與血漿蛋白結(jié)合，成為結(jié)合型藥物，暫時失去一般藥理活性，并 “儲存”在血液中。一般蛋白結(jié)合率高的藥物體內(nèi)消除較慢，作用時間長。P<0.05 的細胞組成有13個，包括蛋白質(zhì)復合體、胞外區(qū)、胞核、胞質(zhì)、細胞外間隙等。

對鹿茸作用于腎癌的主要的20個靶點進行KEGG 通路富集分析，得到 P<0. 05 的通路34條。其中HIF-1信號通路、TGF-β信號通路、MAPK信號通路等與腎癌有關(guān)。HIF-1是一類轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。在正常條件下，HIF-1處于不穩(wěn)定狀態(tài)，通過VHL介導的泛素化降解;在缺氧條件下，HIF-1處于穩(wěn)定狀態(tài)，可激活相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達，導致細胞發(fā)生損傷、增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等一系列過程。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在腎癌的發(fā)生和發(fā)展過程中VHL/HIF信號通路起著十分重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制VHL/HIF信號通路，腎癌細胞增殖活性降低，侵襲和轉(zhuǎn)移能力減弱。TGF-β是腫瘤微環(huán)境中的重要成分之一，可由腫瘤細胞及間質(zhì)細胞等多種成分分泌。TGF-β與其受體結(jié)合后可通過Smad依賴或非依賴方式介導信號轉(zhuǎn)導，調(diào)控腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。有研究表明，TGF-β在腎癌等腫瘤具有較高的表達水平，且血清與尿中的TGF-β水平與腎癌患者預后呈負相關(guān)。有多項研究指出，在大腸癌，乳腺癌，腎癌，前列腺癌癥患者中，血清或者腫瘤組織 TGF-β水平明顯高于正常人。 MAPK信號通路能介導如炎性細胞因子、細菌產(chǎn)物、物理、化學應(yīng)激等刺激引起的細胞反應(yīng)，可參與多種生理過程，如細胞形成、運動、凋亡、分化及生長增殖等。MAPK途徑被稱為蛋白激酶的級聯(lián)，與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。有研究表明，MAPK信號通路可能參與腎細胞癌進展過程中的增殖和轉(zhuǎn)移過程中miR-106b/CIC軸的調(diào)控。

綜上所述，鹿茸治療腎細胞癌的有效成分主要包括三磷酸腺苷、氨基葡萄糖、17-β-雌二醇、前列腺素 E1等，鹿茸可能主要通過抗氧化、抗炎、抑制細胞生長等方面來治療腎細胞癌。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學分析獲得鹿茸治療腎細胞癌的可能有效成分及潛在作用靶點，但本研究僅為預測分析，上述有關(guān)結(jié)論及具體作用機制還有待后續(xù)研究加以論證，不斷完善。

參考文獻

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[3]李春義.鹿茸完全再生機制研究進展[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2017，25（01）：1-10.

作者簡介：

吳玲玲（1995-），漢，女，廣西桂林，碩士在讀，研究方向：泌尿外科。

通訊作者：

高宏君（1972-），滿，男，吉林長春，博士，主任醫(yī)師，研究方向：泌尿外科，器官移植。

基金項目：

1.廣西自然科學基金面上項目，2017GXNSFAA198080.

2.廣西壯族自治區(qū)中青年教師基礎(chǔ)能力提升項目，2019KY0317.

3.廣西中醫(yī)藥大學2018年廣西一流學科建設(shè)項目重點課題，2018XK085.

4.廣西中醫(yī)藥大學2019-2011年廣西一流學科建設(shè)項目，2019XK173.

5.廣西中醫(yī)藥大學2019-2011年廣西一流學科建設(shè)項目青年基金項目，2019XK176.