趙勝男 劉素麗 徐楊璐 李守拙

摘 要 目的：研究不同生長期春秋兩季采收黃芩藥材中有效成分種類及含量的差異，為確定黃芩的最佳采收期提供技術(shù)支持。方法：對赤峰產(chǎn)黃芩不同采收期藥材樣品（一年、二年、三年生長期，在各年份的春季和秋季分別采挖），應(yīng)用紅外光譜三級鑒別技術(shù)（IR-TL）分析其整體成分構(gòu)成變化，以高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）分析藥材中6種黃酮類成分（千層紙素A、白楊素、黃芩素、漢黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷）含量的變化。結(jié)果：IR-TL分析結(jié)果顯示，不同生長期黃芩所含黃酮類、苷類、糖類、酯類等成分均有所不同，其中二年生黃芩中的苷類物質(zhì)含量最高、藥材質(zhì)量更穩(wěn)定；6種黃酮類成分含量測定結(jié)果顯示，不同采收期對上述指標(biāo)成分含量有較大影響，其中二年生春季采收樣品的整體含量高于同年份秋季采收樣品。結(jié)論：本研究可為黃芩藥材質(zhì)量的控制提供可靠的分析方法；二年生長期春季采收可能為黃芩的最佳采收時間。

關(guān)鍵詞 黃芩；紅外光譜三級鑒別；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；采收期；鑒定；含量測定；質(zhì)量控制

Study on the Quality of Scutellaria baicalensis with Different Harvesting Periods by IR-TL and HPLC-MS

ZHAO Shengnan，LIU Suli，XU Yanglu，LI Shouzhuo（TCM Institute of Chengde Medical College， Chengde Medical College/Hebei Key Lab of Research and Development for TCM， Hebei Chengde 067000， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study effective component kinds and content difference of Scutellaria baicalensis with different harvesting periods collected in spring and autumn， and to determine the optimal harvesting time. METHODS： IR-IL was used to analyze the constitutions change of the components in S. baicalensis collected in different harvesting periods （annual， biennial and triennial， in spring and autumn， respectively）. HPLC-MS method was used to analyze the contents change of 6 flavonoids （qroxylin A， chrysin， wogonin， wogonoside， baicalin， baicalein）. RESULTS： Results of IR-TL analysis showed that S. baicalensis contained different components such as flavonoids， glycosides， saccharides， easters in different growth stages， among which the contents of glycosides in biennial S. baicalensis were the highest with more stable quality. The results of content determination of 6 flavonoids showed that different harvesting periods had a great influence on the contents of the above indicators. The overall content of biennial samples collected in spring was higher than that of autumn samples collected in the same year. CONCLUSIONS： This study provides a reliable analytical method for the quality control of S. baicalensis； spring harvest in two-year growth period may be the best harvesting time for S. baicalensis.

KEYWORDS Scutellaria baicalensis； IR-TL； HPLC-MS； Harvesting period； Identification； Content determination； Quality control

對中藥制劑的質(zhì)量起關(guān)鍵性作用的是其制劑工藝的穩(wěn)定性和中藥材質(zhì)量的均一性，但中藥材的品種、采收期、產(chǎn)地﹑儲藏期及儲藏條件等因素[1-4]常導(dǎo)致中藥材的質(zhì)量存在差異，進而影響中藥制劑質(zhì)量的穩(wěn)定性和安全性。采收期是影響中藥材質(zhì)量的重要因素之一，如何確定中藥材的適宜采收期一直是該領(lǐng)域的研究重點和熱點。黃芩為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，其最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中出現(xiàn)，在該書及多種經(jīng)典文獻中均有對其功效的記載[5]，傳統(tǒng)中醫(yī)主要將其用于瀉火解毒、清熱燥濕[6]。本文以黃芩藥材為研究對象，應(yīng)用紅外光譜三級鑒別法（IR-TL）聯(lián)合高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）對不同采收期的藥材樣品進行成分分析。

傳統(tǒng)的中藥材分析方法一般是先對中藥材進行提取分離，然后對提取物進行分析。然而，藥材中的原始物質(zhì)與提取分離后的成分可能具有一定差異，因此傳統(tǒng)分析方法可能無法完全反映原始藥材的真實信息。IR-TL法可在增大樣品光譜分辨率的基礎(chǔ)上逐級放大相似光譜之間的差異，實現(xiàn)對成分復(fù)雜的樣品的區(qū)分[7]。采用IR-TL法對黃芩不提取而直接進行原藥材分析，有望全面反映藥材的整體成分信息。HPLC-MS法綜合了HPLC的分離能力和MS的分辨能力，其MS檢測器是一種高靈敏度﹑高分辨的檢測器，不需要色譜峰完全分離即可準(zhǔn)確定量，尤其適于一些含量較低或者極性相近的成分分析[8]。黃芩中主要有效成分為黃酮類成分，2015年版《中國藥典》（一部）“黃芩”項下是以黃芩苷含量為質(zhì)量控制指標(biāo)[6]，但單個成分無法全面反映中藥材質(zhì)量。因此，本課題組采用IR-TL法聯(lián)合HPLC-MS法，對不同采收期黃芩藥材的成分種類和含量進行綜合分析，并對千層紙素A、白楊素、黃芩素、漢黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷等6種黃酮類成分進行含量測定，旨在為合理確定黃芩的最佳采收期提供可靠的技術(shù)支持。

1 材料

1.1 儀器

Mettler AG245型分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Spectrum GX型FTIR光譜儀（美國PerkinElmer公司）；Agilent 6310型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（包含1100型高效液相色譜儀、6310型質(zhì)譜儀，美國Agilent公司）；CKW-Ⅱ型溫控儀（北京市朝陽自動儀表廠）。

1.2 藥品與試劑

千層紙素A對照品（批號：20091124，純度：>99%）、白楊素對照品（批號：20090518，純度：>99%）、漢黃芩苷對照品（批號：20090319，純度：>99%）均購自上海順勃生物工程技術(shù)有限公司；黃芩素對照品（批號：111595-200604，純度：>99%）、漢黃芩素對照品（批號：111514-200403，純度：>99%）、黃芩苷對照品（批號：715-9506，純度：>99%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為質(zhì)譜純，甲酸、乙醇為分析純，水為純凈水。

1.3 藥材

栽培黃芩藥材采自內(nèi)蒙古赤峰（分別采集一年、二年、三年生的黃芩藥材，在各年份的春季和秋季分別采挖），所有藥材均采自同一地塊，課題組在每個時間點選取其中質(zhì)量較好的10株作為試驗樣品（一年生春季采挖的10株樣品編號為1-1-1～1-1-10，秋季采挖的10株樣品編號為1-2-1～1-2-10；二年生春季采挖的10株樣品編號為2-1-1～2-1-10，秋季采挖的10株樣品編號為2-2-1～2-2-10；三年生春季采挖的10株樣品編號為3-1-1～3-1-10，秋季采挖的10株樣品編號為3-2-1～3-2-10）。本課題組成員親自考察藥材產(chǎn)地并進行采挖，所采藥材由中國科學(xué)院植物研究所與進化植物學(xué)國家重點實驗室周世良研究員鑒定為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根。

2 IR-TL法檢測黃芩藥材中化學(xué)成分組成

2.1 樣品檢測

取藥材樣品適量，粉碎，過篩（200目），稱取樣品粉末2 mg和溴化鉀約200 mg，于瑪瑙研缽中輕輕研磨混勻后壓片，立刻進行紅外光譜檢測。采用Spectrum v3.02操作軟件（PerkinElmer公司）獲得二階導(dǎo)數(shù)紅外圖譜（平滑點數(shù)為13）。選擇400 cm-1與2 000 cm-1為光譜基線起止點，計算光譜特征峰的高度比，然后將樣品壓片裝入程序控制變溫附件中，以升溫速度2 ℃/min加熱，每隔10 ℃（50～120 ℃）檢測樣品的IR-TL光譜，計算二維相關(guān)數(shù)據(jù)[9]，得到二維紅外光譜。

2.2 IR-TL光譜數(shù)據(jù)分析

2.2.1 不同生長年份黃芩的一級紅外光譜 本研究所獲一級紅外光譜結(jié)果顯示，一年生黃芩的各樣品譜圖之間有較大區(qū)別，有的樣品譜圖中有明顯的1 059 cm-1峰，其代表了糖類吸收峰；有的樣品譜圖中有明顯的1 071 cm-1峰，其代表了苷類吸收峰；有的樣品譜圖中有明顯的C=O伸縮振動峰1 740 cm-1，其代表了酯類吸收峰[9-11]。二年生黃芩的各樣品譜圖間的一致性較高，所有樣品的譜圖中均含有1 071、1 740 cm-1峰。三年生黃芩的各樣品譜圖間也有較大差異，部分樣品譜圖中的1 071 cm-1峰移至1 059 cm-1，并且有的樣品譜圖中無明顯的1 740 cm-1峰。3個生長年份黃芩樣品的紅外光譜圖有明顯差異，其中二年生黃芩有代表黃酮類成分苯環(huán)骨架振動吸收峰的1 614 cm-1峰[12-13]，其信號稍弱于三年生樣品，同時1 740 cm-1峰明顯強于一年或三年生樣品。不同生長年份春季采收黃芩藥材的一級紅外光譜對比圖見圖1（限于篇幅，秋季采收樣品的圖譜略，下同）。

2.2.2 不同生長年份黃芩的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜 二階導(dǎo)數(shù)光譜可在一級光譜基礎(chǔ)上增大信號峰的分辨率，提供更多的信號信息[5]。本研究所獲二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜顯示，不同生長年份黃芩藥材的二階導(dǎo)數(shù)紅外譜圖在1 100～840 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)有一定差異：（1）在999～988 cm-1范圍內(nèi)均有2個信號峰，其中一年生黃芩這2個峰信號較弱、強度接近；二年生黃芩這2個峰信號強度明顯增強；三年生黃芩與二年生黃芩比較變化不明顯。（2）在875 cm-1峰處，二年生黃芩的信號最強，一年生黃芩次之，三年生黃芩最弱。（3）在845 cm-1峰處，一年、二年生黃芩的信號強度變化不大，但是三年生黃芩在該峰處的信號幾乎消失。由此表明，不同生長年份黃芩中所含成分種類和含量不同，以二年時達到成分種類和含量的最高峰。不同生長年份春季采收黃芩的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜對比圖見圖2。

2.2.3 不同生長年份黃芩的二維相關(guān)紅外光譜 二維紅外光譜圖可通過光譜顏色區(qū)分信號強度，其中橙紅色區(qū)域信號最強，代表此區(qū)域成分含量較高，其次為黃色區(qū)域，藍色和綠色區(qū)域信號則較弱[9]。圖3為不同生長年份黃芩在1 150～900 cm-1范圍內(nèi)的二維光譜，此波段主要反映糖類C—O振動基團或苷類[14-15]。由圖3可見，一年生黃芩譜圖中存在4個主要的信號峰，分別為1 031、1 010、970、909 cm-1，其中以970 cm-1峰信號最強，此波段代表糖類成分[14]，由此提示該生長年份樣品中含有較多糖類成分；二年生黃芩譜圖中同樣有4個主要信號峰，分別為1 120、1 080、980、940 cm-1，其中以1 080 cm-1峰信號最強，此波段代表苷類成分[15]，由此提示該生長年份樣品含有較多苷類成分；三年生黃芩譜圖中有2個較強信號峰，分別為1 120、1 080 cm-1，其中以1 080 cm-1峰信號最強，但是與二年生樣品比較，其糖類信號峰區(qū)域970、909 cm-1的信號強度和苷類信號峰區(qū)域1 120、1 080 cm-1的信號強度均變?nèi)酰倚盘柗逦恢梦匆娒黠@移動。這提示三年生黃芩的糖類和苷類成分種類和含量變化明顯，與二年生黃芩比較上述成分有所減少。

3 HPLC-MS法測定黃芩藥材中6種黃酮類成分的含量

3.1 溶液的制備

3.1.1 對照品溶液 精密稱量千層紙素A 對照品0.12 mg、白楊素對照品0.12 mg、黃芩素對照品8.38 mg、漢黃芩素對照品2.09 mg、黃芩苷對照品17.74 mg、漢黃芩苷對照品4.66 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，作為各對照品貯備液；精密量取上述貯備液1 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成千層紙素A、白楊素、黃芩素、漢黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷質(zhì)量濃度分別為1.20、1.20、83.8、20.9、177.4、46.6 ?g/L的溶液，作為各對照品溶液。

3.1.2 供試品溶液 精密稱量藥材粉末約0.25 g，置于50 mL平底燒瓶中，精密加入混合溶劑[冰醋酸-乙酸乙酯-乙醇-水（1 ∶ 5 ∶ 49 ∶ 50，V/V/V/V）]25 mL，100 ℃加熱回流90 min后，靜置5 min，取上清液，以0.45 μm有機膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.2 色譜條件與質(zhì)譜條件

3.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，18%A→20%A；10～18 min，20%A→25%A；18～30 min，25%A→30%A；30～40 min，30%A→40%A；40～60 min，40%A→60%A）；柱溫：25 ℃；檢測波長：276 nm；流速：0.2 mL/min；進樣量：2 μL[16]。

3.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子（ESI）源；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；采用正離子模式檢測；噴霧電壓：3 500 V，離子源溫度：350 ℃；質(zhì)荷比（m/z）掃描范圍：100～1 200。其中，千層紙素A m/z：285→270，碰撞電壓：1.00 V；白楊素m/z：255→153，碰撞電壓：0.92 V；黃芩素m/z：271→123，碰撞電壓：0.67 V；漢黃芩素m/z：286→270，碰撞電壓：1.00 V；黃芩苷m/z：447→271，碰撞電壓：0.22 V；漢黃芩苷m/z：461→285，碰撞電壓：1.00 V。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取各對照品溶液適量，加甲醇稀釋制成千層紙素A質(zhì)量濃度分別為0.04、0.06、0.15、0.30、0.60、1.20 μg/mL，白楊素質(zhì)量濃度分別為0.04、0.06、0.15、0.30、0.60、1.20 μg/mL，黃芩素質(zhì)量濃度分別為2.62、5.23、10.48、20.95、41.90、83.80 μg/mL，漢黃芩素質(zhì)量濃度分別為0.30、0.52、2.61、5.22、10.50、20.90 μg/mL，黃芩苷質(zhì)量濃度分別為8.86、11.10、22.20、44.40、88.60、177.40 μg/mL，漢黃芩苷質(zhì)量濃度分別為3.63、5.83、11.70、15.50、23.30、46.60 μg/mL的系列對照品溶液，再按“3.2”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣測定。以各對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL）、峰面積（MRM模式）為縱坐標(biāo)（y）進行回歸分析，結(jié)果見表1。6種成分回歸方程的r值均大于0.999，表明各對照品在上述質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3.2 精密度試驗 取“3.1.2”項下制備的同一供試品溶液（樣品編號：2-10-1），按“3.2”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣測定6次。結(jié)果顯示，千層紙素A、白楊素、黃芩素、漢黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷峰面積RSD分別為2.02%、1.18%、2.44%、0.61%、0.94%、1.10%（n=6），表明方法精密度良好。

3.3.3 重復(fù)性試驗 精密稱取藥材樣品（樣品編號：2-10-1）約0.25 g，共6份，按“3.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“3.2”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣測定。結(jié)果顯示，千層紙素A、白楊素、黃芩素、漢黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷含量的RSD分別為1.08%、2.52%、1.68%、1.32%、2.28%、1.52%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

3.3.4 穩(wěn)定性試驗 取“3.1.2”項下制備的同一供試品溶液（樣品編號：2-10-1），分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h時按“3.2”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣測定。結(jié)果顯示，千層紙素A、白楊素、黃芩素、漢黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷峰面積的RSD分別為2.68%、1.95%、1.67%、0.51%、1.86%、2.23%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取黃芩樣品（樣品編號：2-10-1）0.125 g，共6份，分別精密加入各對照品貯備液適量，按“3.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“3.2”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣測定并計算加樣回收率。結(jié)果顯示，千層紙素A、白楊素、黃芩素、漢黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷平均加樣回收率分別為99.8%、98.9%、99.8%、100.6%、100.2%、98.1%，RSD分別為1.90%、1.44%、2.99%、2.27%、3.59%、1.77%（n=6），表明方法準(zhǔn)確度良好。

3.4 樣品含量測定

取所有黃芩藥材樣品各適量，按“3.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“3.2”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣測定，以各待測成分的峰面積（MRM模式）代入表2中的線性回歸方程，計算待測成分含量。樣品中6種黃酮類成分含量測定結(jié)果見表2、表3，離子流示意圖見圖4。

結(jié)果顯示，赤峰產(chǎn)一年到三年生春季采收的藥材樣品中千層紙素A平均含量由0.035%逐漸升至0.172%，白楊素平均含量由0.008%逐漸升至0.065%，黃芩素平均含量由0.34%逐漸升至2.71%，漢黃芩素平均含量由1.71%逐漸升至6.10%，黃芩苷平均含量由11.99%升至13.58%再降至11.48%，漢黃芩苷平均含量由3.35%逐漸降至0.51%，總黃酮平均含量由17.43%升至21.43%再降至21.04%；秋季采收黃芩中千層紙素A平均含量由0.057%逐漸降至0.029%，白楊素平均含量由0.017%降至0.008%再升至0.011%，黃芩素平均含量由0.74%逐漸降至0.25%，漢黃芩素平均含量由3.04%逐漸降至1.48%，黃芩苷平均含量由12.77%逐漸降至9.68%，漢黃芩苷平均含量由3.42%逐漸降至0.64%，總黃酮平均含量由20.04%逐漸降至12.09%。由此可知，不同采收期對黃芩藥材中這6種成分含量有較大影響，其中二年生春季采收樣品的整體含量高于同年份秋季采收樣品。

3 討論

黃芩屬多年生草本植物，其所含有效成分種類及含量會隨著不同生長期有著較大的波動。目前對于黃芩采收期的確定多選用HPLC法測定其中單個或幾個成分的含量作為指標(biāo)，如繆曉素等[17]采用HPLC法對不同采收期黃芩有效成分的含量進行了研究，安瑜等[18]采用HPLC法對不同采收期黃芩中黃芩苷的含量進行了研究。這些研究多采用單一分析手段或以幾個目標(biāo)成分為指標(biāo)，當(dāng)藥材中有極性相近的成分干擾時，或者某些成分含量較低時，對結(jié)果的影響較大。而本研究綜合IR-TL法和HPLC-MS法對不同采收期黃芩進行研究，首先對原藥材不分離即進行成分定性檢測，再對6種主要黃酮類成分進行定量測定，可獲得更加全面的原藥材物質(zhì)信息。

本研究通過三級紅外光譜中特征峰位置和信號強度判斷，不同生長期黃芩所含糖類成分不同，其中二年生黃芩中的苷類物質(zhì)含量最高。而通過一級紅外光譜對同一生長年份的不同樣本的比較結(jié)果提示，三年生黃芩成分組成不穩(wěn)定，其可能原因在于黃芩生長到第三年時會有部分變成枯芩，造成酯類成分含量降低，有效成分苷類會分解成糖類成分。由于結(jié)果數(shù)據(jù)較多，筆者在本文只列出了3個生長年份春季采收樣品的對比結(jié)果，而秋季采收樣品所得紅外三級光譜比較結(jié)果與春季樣品相同。筆者綜合不同年份樣品的多個成分指標(biāo)后認為，二年生黃芩質(zhì)量可能更穩(wěn)定。本課題組曾對比了二年生春秋兩季采收黃芩的紅外光譜，結(jié)果顯示，秋季采收樣品中黃酮類、酯類成分的含量要低于春季采收樣品，且兩季樣品所含糖類成分種類不同（已另文發(fā)表）[19]。綜合考慮上述結(jié)果，從保證用藥質(zhì)量并縮短藥材種植時間出發(fā)，初步確定二年生春季采挖可能為黃芩的最佳采收期。

此外，考慮到黃酮類成分為黃芩的主要有效成分，因此基于市面上能獲取的相應(yīng)對照品，本研究對6種黃酮類成分進行了含量測定，尤其是對其中含量較低的千層紙素A和白楊素進行了準(zhǔn)確定量。由于黃酮類成分本身有紫外吸收，研究者通常認為紫外檢測器完全可以滿足檢測條件。但本課題組在前期對比紫外檢測器和MS檢測器時發(fā)現(xiàn)，所測6種成分中，除了黃芩苷含量測定結(jié)果差別不大外，其他5種成分的測定結(jié)果均有不同程度的差異，尤其是含量較低的千層紙素A和白楊素（將另文報道）。因此，本研究重點對質(zhì)譜條件進行了優(yōu)化：首先，對比ESI源和大氣壓離子（APCI）源后發(fā)現(xiàn)，前者檢測條件下6種待測成分的靈敏度更高；其次，采用交替離子模式進行條件考察，結(jié)果顯示正離子模式下得到的離子碎片數(shù)據(jù)更多；最后，在MRM模式下測定時，以每種成分的離子對響應(yīng)值在0.1～1.2 V范圍內(nèi)對碰撞電壓進行考察，并優(yōu)選出各成分最適宜的碰撞電壓。本研究通過比較6種黃酮類成分含量測定結(jié)果，進一步確定了不同采收期黃芩質(zhì)量存在差異，并證實二年生春季采收樣品的質(zhì)量整體優(yōu)于同年份秋季采收樣品。2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定黃芩在春、秋兩季采挖[6]，但本研究結(jié)果提示，兩季黃芩藥材的成分構(gòu)成及含量有差異，其臨床藥效可能也會不同。

綜上所述，本研究采用了IR-TL法和HPLC-MS法對黃芩藥材進行了成分鑒定與含量測定，可為其質(zhì)量控制提供可靠的分析方法；同時，確定二年生春季采挖為黃芩的最佳采收期。但本研究只是從化學(xué)成分變化的角度評價不同采收期黃芩質(zhì)量的優(yōu)劣，但這些化學(xué)信息能否代表藥材療效的優(yōu)劣，還需進一步研究；此外，本研究采用的分析技術(shù)雖能在一定程度上盡可能多地反映了黃芩成分變化，但仍需進一步運用更多技術(shù)，建立目標(biāo)成分與藥效的關(guān)系，以完善黃芩藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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（收稿日期：2018-12-24 修回日期：2019-04-30）

（編輯：段思怡）