黃祎 周剛 鐘珊 周智 扈曉宇

摘 要 目的：研究雙參飲對(duì)肝纖維化模型大鼠的肝功能和肝纖維化程度的改善作用及其機(jī)制。方法：取健康SD大鼠，以含40%四氯化碳的橄欖油溶液連續(xù)7周腹腔注射，建立肝纖維化模型。將造模成功的47只大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和雙參飲低、中、高劑量組，各組分別為9、9、9、10、10只；另取10只健康SD大鼠作為正常組。從造模結(jié)束后次周開(kāi)始，模型組與正常組大鼠灌胃水，陽(yáng)性對(duì)照組[秋水仙堿0.2 mg/（kg·d）]和雙參飲各劑量組[雙參飲水煎液3、6、12 g/（kg·d），以總生藥量計(jì)算]大鼠分別灌胃相應(yīng)藥液，連續(xù)給藥28 d。采用賴氏分析法檢測(cè)血清中肝功能指標(biāo)[丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）]水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中肝纖維化指標(biāo)[透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型膠原（Ⅲ-PC）、Ⅳ型膠原前體（Ⅳ-C）]水平；采用蘇木精-伊紅染色法和苦味酸酸性復(fù)紅染色法觀察大鼠肝組織病理學(xué)變化；采用分光光度法檢測(cè)大鼠肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、羥脯氨酸（HYP）水平；采用免疫組化法檢測(cè)大鼠肝組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)水平。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、TBIL、HA、LN、PC-Ⅲ、Ⅳ-C水平均顯著升高，ALB水平顯著降低（P<0.05）；大鼠肝組織出現(xiàn)空泡變性、纖維組織增生等病理現(xiàn)象；肝組織中SOD水平顯著降低，MDA、HYP水平均顯著升高（P<0.05）；肝組織中可見(jiàn)大量α-SMA蛋白陽(yáng)性染色顆粒，其蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，雙參飲各劑量組大鼠血清中ALT、AST和肝纖維化指標(biāo)水平均顯著降低，ALB水平顯著升高，雙參飲中、高劑量組TBIL水平均顯著降低（P<0.05）；肝細(xì)胞變性、纖維化組織增生現(xiàn)象均有較大改善；肝組織中SOD水平顯著升高，MDA、HYP水平均顯著降低（P<0.05）；α-SMA蛋白陽(yáng)性染色明顯減少，其蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。結(jié)論：雙參飲對(duì)肝纖維化模型大鼠有保肝、抗肝纖維化的作用，其機(jī)制可能主要是通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力、下調(diào)α-SMA蛋白表達(dá)、抑制肝星狀細(xì)胞的活化、減少細(xì)胞外間質(zhì)的合成，從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程。

關(guān)鍵詞 雙參飲；丹參；人參；肝纖維化；機(jī)制；大鼠

Study on Improvement Effect and Mechanism of Shuangshen Yin on Liver Fibrosis Model Rats

HUANG Yi1，ZHOU Gang2，ZHONG Shan3，ZHOU Zhi3，HU Xiaoyu1（1. Chengdu University of TCM， Chengdu 610075，China； 2. Bazhong Traditional Chinese Medicine Hospital， Sichuan Bazhong 636600， China； 3. Dept. of Infectious Disease，the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing 400010， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study improvement effect and mechanism of Shuangshen yin on liver function and the degree of liver fibrosis in liver fibrosis model rats. METHODS： Healthy SD rats were collected and given 40% CCl4 olive oil solution intraperitoneally for consecutive 7 weeks to induce liver fibrosis model. 47 model rats were randomly divided into model group， positive control group and Shuangshen yin low-dose， medium-dose and high-dose groups， with 9， 9， 9， 10， 10 rats respectively； another 10 healthy SD rats were included in normal group. From the next week after model induction， model group and normal group were given water intragastrically； positive control group [colchicines 0.2 mg/（kg·d）] and Shuangshenyin groups [Shuangshen yin water decoction 3， 6， 12 g/（kg·d）， by crude drug] were given corresponding medicines respectively for consecutive 28 d. The serum levels of liver function indicators （ALT， AST， TBIL， ALB， GLB） were determined by Ryes analysis method. The serum levels of liver fibrosis indexes （HA， LN， Ⅲ-PC， Ⅳ-C） were determined by ELISA. The pathological changes of liver tissues were observed by HE staining and VG staining. The levels of SOD， MDA and HYP in liver tissues were determined by spectrophotometry. The expression of α-SMA was detected by immunohistochemistry. RESULTS： Compared with normal group， the serum levels of ALT， AST， TBIL， HA， LN， PC-Ⅲ and Ⅳ-C in model group were increased significantly， and the level of ALB was decreased significantly （P<0.05）. There were some pathological phenomena such as vacuolar degeneration and fibrous tissue proliferation in rat liver. The levels of SOD in liver tissue were decreased significantly， while the levels of MDA and HYP were increased significantly （P<0.05）. A large number of positive staining granules of α-SMA protein were observed in liver tissue， and the expression level of α-SMA protein was significantly increased （P<0.05）. Comparison of model group， the serum levels of ALT， AST and liver fibrosis indexes were significantly decreased and ALB level was significantly increased in Shuangshen yin groups， while the TBIL levels in Shuangshen yin medium-dose， high-dose groups were significantly decreased （P<0.05）； the phenomena of hepatocyte degeneration and fibrosis tissue proliferation were significantly improved； the levels of SOD in liver tissue were significantly increased， and the levels of MDA and HYP were significantly decreased （P<0.05）； the positive staining of α-SMA protein decreased significantly， and the expression level of α-SMA protein was decreased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： Shuangshen yin has protective and anti-fibrotic effects on liver in rats with hepatic fibrosis， the mechanism of which may be associated with enhancing antioxidant capacity， down-regulating the expression of α-SMA， inhibiting the activation of hepatic stellate cells， reducing extracellular matrix synthesis so as to reverse liver fibrosis.

2.3 大鼠肝臟組織病理學(xué)觀察

各組大鼠取肝相同部位組織，在10%的甲醛中固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片（厚度：6 μm），進(jìn)行HE或VG染色，在顯微鏡下觀察肝細(xì)胞炎癥程度及纖維化改變等情況。

2.4 大鼠肝組織中SOD、MDA、HYP水平檢測(cè)

采用分光光度法檢測(cè)。取“2.3”項(xiàng)下部分肝組織，按9倍質(zhì)量比加入冰生理鹽水碾磨制成組織勻漿，以3 000 r/min離心5 min，取上清液，按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，檢測(cè)SOD、MDA、HYP水平。

2.5 大鼠肝組織中α-SMA蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用免疫組化法檢測(cè)。取“2.3”項(xiàng)下制作的石蠟切片，脫蠟，抗原修復(fù)，滴加兔α-SMA多克隆抗體（1 ∶ 800）后，置于孵育盒中于4 ℃孵育18～24 h；PBS洗滌2 min×3次，按NovoLink聚合物檢測(cè)系統(tǒng)RE7159試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行染色處理后，于顯微鏡下觀察每個(gè)視野中陽(yáng)性染色情況（即鏡下呈棕褐色顆粒者）；同時(shí)，采用Image Pro Plus 6.0軟件分析陽(yáng)性染色部分的光密度值（OD），用來(lái)表示α-SMA蛋白表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠肝功能指標(biāo)水平

與正常組比較，模型組大鼠血清ALT、AST、TBIL水平均顯著升高，ALB水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和雙參飲各劑量組大鼠ALT、AST水平均顯著降低以及ALB水平顯著升高，雙參飲中、高劑量組TBIL水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，雙參飲高劑量組大鼠血清ALT、AST、TBIL水平均顯著減低，ALB水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；各組大鼠血清GLB水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠肝功能指標(biāo)水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 大鼠血清肝纖維化指標(biāo)水平

與正常組比較，模型組大鼠血清HA、LN、PC-Ⅲ、Ⅳ-C水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和雙參飲各劑量組大鼠上述血清肝纖維化指標(biāo)水平均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，雙參飲高劑量組大鼠上述血清肝纖維化指標(biāo)水平均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 大鼠肝組織病理學(xué)變化

鏡下可見(jiàn)，經(jīng)HE或VG染色后，正常組大鼠肝細(xì)胞整齊規(guī)則，中央靜脈清晰可見(jiàn)，未見(jiàn)擴(kuò)張與萎縮；模型組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂、存在大量空泡變性，肝組織匯管區(qū)、中央靜脈周圍可見(jiàn)較多纖維組織增生，甚至形成假小葉，中央靜脈萎縮或消失；陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肝組織有少量肝細(xì)胞水腫變性，匯管區(qū)、中央靜脈周圍可見(jiàn)部分纖維組織增生，肝細(xì)胞壞死及纖維組織增生現(xiàn)象較模型組均有不同程度減輕；雙參飲各劑量組大鼠肝細(xì)胞變性、纖維化組織增生現(xiàn)象較模型組均有較大改善，且中、高劑量組病理學(xué)變化程度較陽(yáng)性對(duì)照組明顯減輕。各組大鼠肝組織病理學(xué)變化顯微圖見(jiàn)圖1、圖2。

3.4 大鼠肝組織中SOD、MDA、HYP水平

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中SOD水平顯著降低，MDA、HYP水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和雙參飲各劑量組大鼠肝組織中SOD水平顯著升高，MDA、HYP水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，雙參飲中、高劑量組大鼠肝組織中SOD水平均顯著升高，MDA水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余指標(biāo)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠肝組織中HYP、SOD、MDA水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

3.5 大鼠肝組織中α-SMA蛋白表達(dá)水平

鏡下可見(jiàn)，正常組大鼠肝組織中僅有少量陽(yáng)性染色顆粒；模型組大鼠肝組織中可見(jiàn)大量棕褐色陽(yáng)性染色顆粒，且主要集中于纖維組織及臨近部位，在匯管區(qū)、中央靜脈可見(jiàn)，而在假小葉及緊鄰的肝竇區(qū)則更加明顯，提示有較多α-SMA蛋白表達(dá)；陽(yáng)性對(duì)照組和雙參飲各劑量組大鼠肝組織中棕褐色陽(yáng)性染色顆粒較之模型組均有不同程度的減少。定量分析結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織中α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和雙參飲各劑量組大鼠肝組織中α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，雙參飲高劑量組大鼠肝組織中α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組大鼠肝組織中α-SMA蛋白表達(dá)顯微圖見(jiàn)圖3，蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

4 討論

雙參飲源于扈曉宇教授治療肝纖維化的基礎(chǔ)方，由人參和丹參兩味藥材組成。扈教授認(rèn)為，肝纖維化多起于先天不足，而又外受濕熱疫毒之邪，正虛邪戀，邪毒留于體內(nèi)，病久則滯則瘀，故本病的基本病機(jī)在于氣虛血瘀，血瘀貫穿于整個(gè)病程的始終。據(jù)我國(guó)《別錄》《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草綱目》等醫(yī)藥古籍記載，丹參活血而不傷正；人參助丹參活血祛瘀之功，補(bǔ)氣而不壅滯；兩藥相伍，可共同發(fā)揮益氣扶正、活血化瘀的治療作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也證實(shí)，人參皂苷Rg1能提高肝纖維化模型大鼠細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中的降解酶水平，并可顯著降低大鼠體內(nèi)活性氧的含量[7]；人參皂苷czh-A-69能有效抑制肝星狀細(xì)胞（HSC）的激活[8]；丹參主要是通過(guò)抑制新生血管活性并調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的途徑發(fā)揮抗纖維化的作用[9]；丹參酮ⅡA能發(fā)揮抑制HSC活化的作用，其機(jī)制可能與減少枯否細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子表達(dá)有關(guān)[10]。前期通過(guò)隨機(jī)對(duì)照的方法，經(jīng)103例慢性乙型肝炎肝纖維化患者臨床試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，聯(lián)用雙參飲治療能有效改善患者肝臟生化指標(biāo)，減輕其肝纖維化程度，緩解其臨床癥狀及體征[2]。

ALT、AST、TBIL的水平可較準(zhǔn)確地反映肝組織損傷程度[11]；ALB的水平也可作為反映肝功能的靈敏指標(biāo)，用于協(xié)助診斷肝臟疾病[12]。肝纖維化4項(xiàng)（HA、Ⅳ-C、LN、Ⅲ-PC）是ECM的主要成分，而ECM含量高低與肝纖維化程度呈正相關(guān)，因此這4項(xiàng)指標(biāo)水平可用于評(píng)價(jià)肝纖維化的病變程度[13]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，雙參飲各劑量組大鼠血清中ALT、AST和肝纖維化4項(xiàng)水平均顯著降低，ALB水平均顯著升高，而雙參飲中、高劑量組TBIL水平顯著降低；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，雙參飲高劑量組大鼠血清ALT、AST、TBIL和肝纖維化4項(xiàng)水平均顯著降低，ALB水平顯著升高。這表明雙參飲有保肝、抗肝纖維化的作用，且呈劑量依賴趨勢(shì)。

肝組織中SOD、MDA水平與肝臟過(guò)氧化有關(guān)。其中，SOD下降的程度能直接反映肝損傷程度；MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物，可反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，能間接反映肝細(xì)胞損傷的程度[14-15]；而HYP與肝臟纖維化有關(guān)，是評(píng)估肝臟纖維化程度的有效指標(biāo)[16]。肝纖維化的形成機(jī)制主要是由多種損傷因素造成肝竇內(nèi)的HSC發(fā)生活化和增殖，致使肝臟組織內(nèi)ECM的過(guò)度生成、大于降解，從而引發(fā)肝小葉、界板區(qū)及匯管區(qū)的纖維增生，而α-SMA正是活化的HSC的特征標(biāo)志物[17]。本研究結(jié)果顯示，雙參飲干預(yù)治療后，能減少模型大鼠彌漫性肝細(xì)胞中空泡變性的產(chǎn)生和纖維組織增生，延緩肝纖維化的進(jìn)程；能顯著下調(diào)大鼠肝組織中MDA、HYP水平，上調(diào)SOD水平，并下調(diào)α-SMA的蛋白表達(dá)。

綜上，雙參飲對(duì)肝纖維化大鼠有保肝、抗肝纖維化的作用，其機(jī)制可能主要是通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力、下調(diào)α-SMA蛋白表達(dá)、抑制HSC的活化、減少ECM的合成，從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程。但肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程涉及的機(jī)制極其復(fù)雜，并受多種因素影響，本研究?jī)H對(duì)雙參飲改善肝纖維化的作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究，而該方其他可能的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 梁擴(kuò)寰，李紹白.肝臟病學(xué)[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2016：796.

[ 2 ] 張俊立.雙參飲對(duì)慢性乙型肝炎肝纖維化的干預(yù)作用[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

[ 3 ] KOH EK，KIM JE，SONG SH，et al. Ethanol extracts collected from the styela clava tunic alleviate hepatic injury induced by carbon tetrachloride （CCl4） through inhibition of hepatic apoptosis，inflamation，and fibrosis[J]. J Toxicol Pathol，2017，30（4）：291-306.

[ 4 ] LEE GH，LEE HY，CHOI MK，et al. Protective effect of Curcuma longa L. extract on CCl4-induced acute hepatic stress[J]. Bmc Res Notes，2017. DOI：10.1186/s13104-017- 2409-z.

[ 5 ] 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)肝病專業(yè)委員會(huì).肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2006，4（6）：551-555.

[ 6 ] 劉自安.賴氏法與丙酮酸氧化酶法檢測(cè)ALT在血站實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2009，11（6）：117.

[ 7 ] GENG JW，PENG W，HUANG YG，et al. Ginsenoside- Rg1 from Panax notoginseng prevents hepatic fibrosis induced by thioacetamide in rats[J]. Eur J Pharmacol，2010，634（1/2/3）：162-169.

[ 8 ] 宋順宗.山茱萸新苷和人參皂苷保護(hù)及抗肝纖維化作用的研究[D].延吉：延邊大學(xué)，2011.

[ 9 ] 劉洪亮，呂靖，趙志敏，等.丹參水溶性成分抑制肝竇內(nèi)皮細(xì)胞功能及血管新生的活性評(píng)價(jià)[J].中草藥，2016，47（6）：938-943.

[10] LIU YW，HUANG YT. Inhibitory effect of tanshinone ⅡA on rat hepatic stellate cells[J]. PLoS One，2014. DOI：10.1371/journal.pone.0103229.

[11] 劉偉，符小紅，黃思遠(yuǎn)，等.藏藥波棱瓜子總木脂素對(duì)四氯化碳致大鼠肝纖維化的保護(hù)作用及機(jī)制探討[J].中國(guó)中藥雜志，2017，42（3）：567-571.

[12] CHEN MS，ZHANG JH，WANG JL，et al. Anti-fibrotic effects of neferine on carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis in mice[J]. Am J Chin Med，2015，43（2）：231-240.

[13] 錢宏波，錢媛，趙漢東. HA、PC-Ⅲ、LN、Ⅳ-C在原發(fā)性肝癌診斷及判斷手術(shù)預(yù)后中的價(jià)值[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2016，25（11）：1286-1288.

[14] 劉軍.超氧化物歧化酶的研究進(jìn)展[J].天津藥學(xué)，2000，12（4）：23-24.

[15] 姚翠鸞，王維娜，王安利.水生動(dòng)物體內(nèi)超氧化物歧化酶的研究進(jìn)展[J].海洋科學(xué)，2003，27（10）：18-21.

[16] 徐珊，周敏，包劍鋒，等.肝纖維化不同證型與肝功能和肝組織羥脯氨酸關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（9）：1855-1857.

[17] SCHNABL B，KWEON YO，F(xiàn)REDERICK JP，et al. The role of Smad3 in mediating mouse hepatic stellate cell activation[J]. Hepatology，2001，34（1）：89-100.

（收稿日期：2019-03-01 修回日期：2019-04-30）

（編輯：段思怡）