周立霞 關洪全 王淳 馬賢德 王丹

摘 要 目的：探討毛蕊異黃酮（CA）通過調控微RNA-21（miR-21）/人類第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）信號通路對肺腺癌細胞增殖和遷移的抑制作用機制。方法：以人肺腺癌SPC-A1細胞為對象，采用MTT法檢測不同劑量CA（5、15、25、50、75、100 μg/mL）作用12、24、48、72 h后的細胞增殖情況，并計算細胞存活率、30%細胞生長抑制濃度（IC30）和半數(shù)抑制濃度（IC50）；采用Transwell遷移試驗檢測低、中、高劑量CA（50、75、100 μg/mL）作用24 h后的細胞遷移情況，記錄染色細胞數(shù)并計算細胞遷移抑制率；采用蛋白質印跡法和實時聚合酶鏈反應法檢測低、中、高劑量CA（50、75、100 μg/mL）作用24 h后細胞miR-21以及PTEN、血管內皮生長因子（VEGF）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）蛋白及其mRNA的表達情況；檢測細胞在分別轉染miR-21模擬物（mimic）和抑制物（inhibitor）后，CA（75 μg/mL）對其miR-21及PETN、VEGF、MMP-9蛋白表達的影響。結果：經50、75、100 μg/mL CA作用12、24、48 h，25、50、75、100 μg/mL CA作用72 h后，細胞存活率均顯著降低（P<0.05或P<0.01）；12～72 h各時間點CA的IC30值分別為82.24、50.45、46.34、31.81 μg/mL，IC50值分別為108.06、73.35、70.08、49.89 μg/mL。與正常對照組比較，CA各劑量組染色細胞數(shù)，低劑量組細胞中VEGF蛋白以及中、高劑量組細胞中miR-21，VEGF、MMP-9蛋白及其mRNA的相對表達量均顯著減少或降低，且中、高劑量組顯著少于或低于低劑量組，高劑量組顯著少于或低于中劑量組（P<0.05或P<0.01）；CA各劑量組細胞遷移率以及中、高劑量組細胞中PTEN蛋白及其mRNA的相對表達量均顯著升高，且中、高劑量組顯著高于低劑量組，高劑量組顯著高于中劑量組（P<0.05或P<0.01）。轉染miR-21 mimic后，miR-21 mimic組細胞miR-21及VEGF、MMP-9蛋白的相對表達量均較正常對照組顯著升高，PTEN蛋白的相對表達量顯著降低（P<0.01）；加入CA干預后，細胞中miR-21及VEGF、MMP-9蛋白的相對表達量均較miR-21 mimic組顯著降低，PTEN蛋白的相對表達量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。轉染miR-21 inhibitor后，miR-21 inhibitor組細胞中miR-21及VEGF、MMP-9蛋白的相對表達量均較正常對照組顯著降低，PTEN蛋白的相對表達量顯著升高（P<0.05或P<0.01）；加入CA干預后，細胞中miR-21及上述蛋白的表達較miR-21 inhibitor組均未見明顯變化（P>0.05）。結論：CA可劑量依賴性地抑制肺腺癌SPC-A1細胞的增殖和遷移，且這種作用可能與調控miR-21/PTEN信號通路有關。

關鍵詞 毛蕊異黃酮；微RNA-21/人類第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物信號通路；肺腺癌；SPC-A1細胞；增殖；遷移；抑制作用；機制

Study on the miR-21/PTEN Signaling Pathway Mechanisms of Calycosin Inhibiting the Proliferation and Migration of Lung Adenocarcinoma Cells

ZHOU Lixia1，GUAN Hongquan1，WANG Chun1，MA Xiande1，WANG Dan2（1. College of Basic Medicine， Liaoning University of TCM， Shenyang 110032， China； 2. Graduate School， Jinzhou Medical University， Liaoning Jinzhou 121001， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the mechanism of calycosin （CA） inhibiting the proliferation and migration of lung adenocarcinoma cells by regulating miR-21/PTEN signaling pathway. METHODS： Using lung adenocarcinoma SPC-A1 cells as objects， cell proliferation was detected by MTT method after treated with different doses of CA （5， 15， 25， 50， 75， 100 μg/mL） for 12， 24， 48， 72 h. Cell survival rate， 30% cell growth inhibition concentration （IC30） and half inhibition concentration （IC50） were calculated. Transwell migration test was used to detect the migration of cells after treated with low-dose， medium-dose and high-dose of CA （50， 75， 100 μg/mL） for 24 h. The number of stained cells was recorded and inhibition rate of cell migration were calculated. Western blotting assay and real-time PCR were used to detect the expression of miR-21 as well as the proteins and their mRNAs expression of PTEN， VEGF， MMP-9 after treated with low-dose， medium-dose and high-dose of CA （50， 75， 100 μg/mL） for 24 h. After transfected with miR-21 mimics and miR-21 inhibitor， the effects of CA （75 μg/mL） on the expression of miR-21 and the protein expression of PETN， VEGF and MMP-9 were detected. RESULTS： After treated with 50， 75， 100 μg/mL CA for 12， 24， 48 h， 25， 50， 75， 100 μg/mL CA for 72 h， cell survival rate was decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. IC30 of CA were 82.24， 50.45， 46.34， 31.81 μg/mL ； IC50 of CA were 108.06， 73.35， 70.08， 49.89 μg/mL during 12-72 h. Compared with normal control group， the number of stained cells in CA groups， protein expression of VEGF in CA low-dose group， expression of miR-21 as well as proteins and their mRNAs expression of VEGF， MMP-9 in CA medium-dose and high-dose groups were decreased significantly； the medium-dose and high-dose groups were significantly less or lower than low-dose group； the high-dose group was significantly less or lower than medium-dose group （P<0.05 or P<0.01）. Cell migration rate of CA groups as well as protein and its mRNA expression of PTEN in CA medium-dose and high-dose groups were increased significantly； the medium-dose and high-dose groups were significantly higher than the low-dose group； the high-dose group was significantly higher than the medium-dose groups （P<0.05 or P<0.01）. After transfected with miR-21 mimics， expression of miR-21 as well as protein expression of VEGF and MMP-9 were increased significantly in miR-21 mimic group， compared with normal control group； protein expression of PTEN was decreased significantly （P<0.01）. After intervened by CA， expression of miR-21 as well as protein expression of VEGF and MMP-9 in cells were decreased significantly， compared with miR-21 mimic group； protein expression of PTEN was increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. After transfected with miR-21 inhibitor， expression of miR-21 as well as protein expression of VEGF and MMP-9 were decreased significantly in miR-21 inhibitor group， compared with normal control group； protein expression of PTEN was increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. After intervened by CA， the expression of miR-21 and above protein had no significant change in cells， compared with miR-21 inhibitor group （P>0.05）. CONCLUSIONS： CA can inhibit the proliferation and migration of lung adenocarcinoma SPC-A1 cells in a dose-dependent manner， which may be associated with the regulation of miR-21/PTEN signaling pathway.

KEYWORDS Calycosin； miR-21/PTEN signaling pathway； Lung adenocarcinoma； SPC-A1 cells； Proliferation； Migration； Inhibitory effect； Mechanism

盡管目前肺癌的診斷和治療方法取得了顯著進展，其近期發(fā)病率和病死率均有所下降，但肺癌仍然是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1]。肺癌診斷方法的發(fā)展雖給患者的生存帶來了一定益處，但由于對肺癌發(fā)病機制的認知有限，加之其尚缺乏典型的早期癥狀，故大部分患者確診時已處于晚期，錯失了手術機會，最終導致臨床干預效果欠佳[2-3]。肺腺癌作為最為常見的非小細胞肺癌，具有腺體/導管形成、大量黏液產生等病理特征，其發(fā)病機制復雜，患者預后較差[4-5]。因此，闡明肺腺癌發(fā)生發(fā)展的分子調節(jié)機制、確定新的早期篩選分子靶點和研發(fā)新的治療藥物具有重要意義。

微RNA（microRNAs）是一類廣泛存在于真核生物體內、長度約為21～25個核苷酸的內源性非編碼蛋白質的進化保守的單鏈小分子RNA，在確定細胞身份、調控基因表達的過程中發(fā)揮著關鍵作用[6]。同時相關研究證實，microRNAs幾乎與所有類型惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[7]。microRNA-21（miR-21）作為一種參與并促進腫瘤發(fā)展的microRNA，被證實可參與調節(jié)人類第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）基因的表達[8-9]。PTEN是新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其編碼蛋白PTEN具有脂質磷酸酶活性；此外，該基因缺失可上調下游血管內皮生長因子（VEGF）和基質金屬蛋白酶9（MMP-9）編碼基因的表達，從而誘導肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)展[10-11]。

毛蕊異黃酮（CA）是一種異黃酮類化合物，是中藥黃芪的主要活性成分之一，具有低毒、多作用靶點等優(yōu)點[12]。近年來研究顯示，CA具有抗腫瘤活性，可通過抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPR）、蛋白激酶B（Akt）、Janus激酶/信號轉導與轉錄激活因子（JAK/STAT）等信號通路抑制乳腺癌等多種腫瘤細胞的增殖[13-14]，但其對肺腺癌細胞影響的研究較少。為此，本研究擬考察CA對肺腺癌細胞增殖和遷移的體外抑制作用，并從調控miR-21靶向基因PTEN的分子角度初步探討CA的抗腫瘤機制，以期為明確其干預肺腺癌發(fā)展的分子機制、完善肺腺癌的臨床治療方法提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ELx 800型酶標儀（美國BioTek公司）、2800-00 Odyssey型雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國LICOR公司）；PROTEAN Ⅱ xi型垂直電泳系統(tǒng)、170-3940型半干法轉膜儀、170-4152型濕法轉膜儀、LAS 4000 mini型化學發(fā)光成像儀、ABI 7500型熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）；T100型PCR儀、Nano Drop 2000型紫外分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；CKX53型倒置顯微鏡、BX31型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；5810R低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 藥品與試劑

CA對照品（批號：B9938，純度：>98%）、MTT試劑（批號：M2128）均購自美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，批號：P6504）、蛋白上樣緩沖液（批號：P196382-1）、RIPA裂解液（批號：C500005）、免疫印跡化學發(fā)光液（ECL）（批號：C510043）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；胰酶（批號：25300054）、青霉素-鏈霉素雙抗（批號：15140163）、胎牛血清（FBS，批號：10100-147）、RPMI 1640培養(yǎng)基（批號：61870044）、Opti-MEM培養(yǎng)基（批號：11058021）均購自美國Gibco公司；TE緩沖液（pH 7.5，上海哈靈生物科技有限公司，批號：HL12441）；Transwell小室（批號：3428）、Matrigel基質膠（批號：356234）均購自美國Corning公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：A53225）；Trizol試劑（批號：87902）、實時聚合酶鏈反應（Real-time PCR）試劑盒（批號：00182806）均購自美國Invitrogen公司；miR-21模擬物（mimic）及其抑制物（inhibitor）的miRNA（批號分別為A0018071、A0028071）均購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；Lipofectamine 2000轉染試劑（美國Invitrogen公司，批號：11668019）；逆轉錄試劑盒（日本Takara公司，批號：D6110A）；小鼠抗人β-肌動蛋白（β-actin）抗體（碧云天生物技術有限公司，批號：AA128）；小鼠抗人PTEN抗體（美國Abcam公司，批號：ab170941）；辣根過氧化物（HRP）標記的羊抗小鼠IgG二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：ab150077）；miR-21、U6引物均由美國GeneCopoeia公司合成；PTEN、MMP-9、VEGF、β-actin引物均由美國Invitrogen公司設計、合成；二甲基亞砜（DMSO）等試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 細胞

人肺腺癌細胞株SPC-A1購自美國ATCC公司。

2 方法

2.1 藥液配制

取CA對照品適量，用DMSO溶解，制成質量濃度為100 μg/mL的貯備液，于4 ℃保存，備用。臨用前，用PBS將上述貯備液稀釋至所需質量濃度，即得。

2.2 細胞培養(yǎng)

取人肺腺癌細胞株SPC-A1適量，用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”）于37 ℃ 、5%CO2培養(yǎng)箱（下同）中培養(yǎng)，每36 h更換1次培養(yǎng)基。待細胞融合至80%～90%時，用0.25%胰酶消化傳代，選取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)試驗。

2.3 CA對SPC-A1細胞存活率的影響

采用MTT法檢測。取對數(shù)生長期細胞，以1×105個/mL的密度按100 μL/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜。將細胞隨機分為正常對照組（加細胞，不加藥物）和CA不同劑量組（5、15、25、50、75、100 μg/mL，劑量設置參考前期預試驗結果），同時設置不加細胞和藥物的空白對照組，每組設3個復孔。棄去培養(yǎng)基，空白對照組和正常對照組加入完全培養(yǎng)基100 μL，各給藥組加入含相應藥物的完全培養(yǎng)基100 μL，分別于培養(yǎng)12、24、48、72 h時棄去培養(yǎng)基；每孔加入MTT試劑10 μL，培養(yǎng)4 h后，棄去上清液；每孔加入DMSO 100 μL，置搖床中于室溫下振搖15 min。使用酶標儀于562 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）。以空白對照組為基準，計算各組的細胞存活率[細胞存活率（%）=（試驗組平均OD值-空白對照組平均OD值）/（正常對照組平均OD值-空白對照組平均OD值）×100%]以及30%細胞生長抑制濃度（IC30）和半數(shù)抑制濃度（IC50）。上述試驗重復3次。

2.4 CA對SPC-A1細胞遷移能力的影響

采用Transwell遷移試驗檢測。取對數(shù)生長期細胞，用完全培養(yǎng)基重懸細胞至1×105個/mL，取上述細胞懸液100 ?L置于Transwell小室上層，下層加入完全培養(yǎng)基500 ?L，培養(yǎng)24 h。將細胞隨機分為正常對照組（加細胞，不加藥物）和CA低、中、高劑量組（50、75、100 μg/mL，劑量設置參考“2.3”項下測得IC30、IC50值），同時設置不加細胞和藥物的空白對照組（為排除其他因素的干擾，下同），每組設3個復孔。棄去培養(yǎng)基，空白對照組和正常對照組于小室上層加入RPMI 1640培養(yǎng)基100 ?L，各給藥組于小室上層加入含相應藥物的RPMI 1640培養(yǎng)基100 ?L，各組小室下層均加入含20%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基500 ?L，培養(yǎng)24 h；棄去上、下層培養(yǎng)基，用棉簽擦拭上層底部未穿過聚碳酸酯膜的細胞，用PBS清洗2次，以甲醇固定30 min，風干15 min；以0.1%結晶紫-甲醛溶液染色20 min，用PBS清洗3次，風干。使用倒置顯微鏡觀察，每孔隨機選取6個視野，拍照并記錄染色細胞數(shù)（即發(fā)生遷移細胞的數(shù)量），同時計算細胞遷移抑制率（%）[細胞遷移抑制率=（正常對照組遷移細胞數(shù)-試驗組遷移細胞數(shù)）/正常對照組遷移細胞數(shù)×100%]。上述試驗重復3次。

2.5 CA對SPC-A1細胞中PTEN、VEGF、MMP-9蛋白表達的影響

采用蛋白質印跡法檢測。取對數(shù)生長期細胞，以1×105個/mL的密度按500 ?L/瓶接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h。按“2.4”項下方法分組，每組設3個復孔。棄去培養(yǎng)基，空白對照組和正常對照組加入完全培養(yǎng)基200 ?L，各給藥組加入含相應藥物的完全培養(yǎng)基200 ?L，培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)基，用4 ℃的PBS清洗2次，加入RIPA裂解液80 ?L，于冰上裂解30 min；在4 ℃下以20 000 r/min離心15 min，收集上清液，采用BCA法測定蛋白濃度，嚴格按相應試劑盒說明書方法操作。蛋白經5×蛋白上樣緩沖液以體積比1 ∶ 4稀釋，在沸水浴中變性10 min后，于-80 ℃保存，備用。每組取上述蛋白30 μg，進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后轉移至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應一抗[β-actin（內參，1 ∶ 1 000）、PETN（1 ∶ 500）、VEGF（1 ∶ 1 000）、MMP-9（1 ∶ 1 000）]，4 ℃孵育過夜，用PBS清洗3次，每次5 min；加入二抗（1 ∶ 5 000），室溫孵育1 h，用PBS清洗3次，每次10 min，于37 ℃搖床中繼續(xù)孵育1 h；經ECL顯色后，置于雙色紅外激光成像系統(tǒng)上成像，采用Image Lab 3.0軟件分析，以目標蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達量。上述試驗重復3次。

2.6 CA對SPC-A1細胞中miR-21及PTEN、VEGF、MMP-9 mRNA表達的影響

采用Real-time PCR法檢測。取對數(shù)生長期細胞，以1×105個/mL的密度按100 ?L/瓶接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h。按“2.5”項下方法分組、給藥。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，采用Trizol法提取細胞總RNA，嚴格按相應試劑說明書操作。將總RNA用焦碳酸二乙酯（DEPC）水20 ?L復溶，取1 ?L，用TE緩沖液以1 ∶ 100的體積比稀釋，使用紫外分光光度計分別于260、280 nm波長處檢測各孔的吸光度，以考察RNA的純度和濃度。參照逆轉錄試劑盒說明書方法將總RNA中的mRNA逆轉錄成cDNA。以上述cDNA為模板，按Real- time PCR試劑盒說明書進行擴增，反應體系（共20 ?L）：SYBR Green Mix 10 ?L，上、下游引物（引物序列見表1）各1 ?L，模板cDNA 2 ?L，ddH2O 6 ?L。反應條件：95 ℃預變性20 s，95 ℃變性10 s，62℃退火30 s，70℃延伸30 s，共40個循環(huán)。分別以β-actin（針對PTEN、VEGF、MMP-9）和U6（針對miR-21）為內參，采用2-ΔΔCt法以ABI Prism? SDS 2.0.3軟件計算各目標mRNA的相對表達量（Ct表示每個反應管內熒光信號強度達到設定閾值時所經歷的循環(huán)數(shù)）。上述試驗重復3次。

2.7 CA對轉染SPC-A1細胞中miR-21及PTEN、VEGF、

MMP-9蛋白表達的影響取對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰酶消化后，以1 000 r/min離心5 min，收集細胞，用完全培養(yǎng)基重懸至2×105個/mL，按100 μL/孔接種于6孔板中，待細胞融合至80%，換無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16 h。將細胞隨機分為正常對照組（不含藥物，不轉染，細胞正常生長）、miR-21 mimic組（不含藥物，轉染miR-21 mi- mic）、miR-21 mimic+CA組[CA 75 μg/mL（劑量設置參考“2.3”項下測得IC50值，下同），轉染miR-21 mimic]、miR-21 inhibitor組（不含藥物，轉染miR-21 inhibitor）和miR-21 inhibitor+CA組（CA 75 μg/mL，轉染miR-21 inhibitor），同時設置不加細胞和藥物的空白對照組，每組設3個復孔。在轉染前，取Lipofectamine 2000轉染試劑5 μL，用Opti-MEM培養(yǎng)基250 ?L稀釋至100 nmol/L，輕輕混勻，室溫孵育5 min；將miR-21 mimic或inhibitor用不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基250 ?L稀釋至50 nmol/L，輕輕混勻，室溫孵育5 min。將上述兩種混合液輕輕混勻，室溫孵育20 min，即得轉染復合物。除空白對照組和正常對照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基100 μL外，其余各組均加入含或不含CA的轉染復合物100 μL進行轉染。轉染培養(yǎng)24 h后，按“2.5”“2.6”項下方法檢測各組細胞中PTEN、MMP-9、VEGF蛋白及miR-21的相對表達量。上述試驗重復3次。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 CA對SPC-A1細胞存活率影響的檢測結果

3.2 CA對SPC-A1細胞遷移能力影響的檢測結果

與正常對照組比較，CA各劑量組染色細胞數(shù)均顯著減少，且中、高劑量組顯著少于低劑量組，高劑量組顯著少于中劑量組；各劑量組細胞遷移抑制率均顯著升高，且中、高劑量組顯著高于低劑量組，高劑量組顯著高于中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖1、表3。

3.3 CA對SPC-A1細胞中PTEN、VEGF、MMP-9蛋白表達影響的檢測結果

與正常對照組比較，CA中、高劑量組細胞中PETN蛋白的相對表達量均顯著升高，且中、高劑量組顯著高于低劑量組，高劑量組顯著高于中劑量組；低劑量組細胞中VEGF蛋白以及中、高劑量組細胞中VEGF、MMP-9蛋白的相對表達量均顯著降低，且中、高劑量組顯著低于低劑量組，高劑量組顯著低于中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、表4。

3.4 CA對SPC-A1細胞中miR-21及PTEN、VEGF、MMP-9 mRNA表達影響的檢測結果

與正常對照組比較，CA中、高劑量組細胞中PTEN mRNA的相對表達量均顯著升高，且中、高劑量組顯著高于低劑量組，高劑量組顯著高于中劑量組；CA中、高劑量組細胞中miR-21及VEGF、MMP-9 mRNA的相對表達量均顯著下降，且中、高劑量組顯著低于低劑量組，高劑量組顯著低于中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見表5。

與正常對照組比較，轉染miR-21 inhibitor后，miR- 21 inhibitor組細胞中miR-21及VEGF、MMP-9蛋白的相對表達量均顯著降低，PTEN蛋白的相對表達量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）；與miR- 21 inhibitor組比較，miR-21 inhibitor+CA組細胞中miR-21及上述蛋白的相對表達量均無明顯變化，組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見圖4、表7。

4 討論

肺癌為呼吸系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，肺腺癌作為一種非小細胞肺癌，其發(fā)病率在逐年上升，對肺腺癌的診斷和治療是目前臨床亟待解決的重要課題[1，15]。大多數(shù)研究者認為，抑制肺腺癌細胞的增殖和轉移是臨床干預治療的重要策略[16]。我國中草藥的應用歷史悠久，已有研究證實許多中藥活性成分具有抗腫瘤作用，且具有毒副作用小、不易耐藥等優(yōu)點[17]。CA是中藥黃芪的主要活性成分之一，近年來大量研究表明，其對結腸癌、乳腺癌、卵巢癌等均具有一定的抑制作用[18-20]，但其對肺癌細胞的體內外抑制作用的相關研究較少。目前，肺癌的發(fā)病率和病死率位居各類腫瘤之首，且臨床干預效果欠佳[2-3，21]。因此，深入研究CA對肺癌的抑制作用具有十分重要的意義。

已有研究表明，CA能夠抑制肺腺癌A549細胞的增殖和侵襲，其抑制遷移和侵襲的作用機制可能與抑制蛋白激酶C-α（PKC-α）途徑，下調MMP-2、MMP-9和整合素β的表達有關[22]。本研究參照前期預試驗結果，采用MTT法考察了不同劑量（5、15、25、50、75、100 μg/mL）CA對肺腺癌SPC-A1細胞增殖的影響。結果顯示，經50、75、100 μg/mL CA作用12、24、48 h，25、50、75、100 μg/mL CA作用72 h后，細胞存活率均較正常對照組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義。這提示當CA達到一定劑量時，其可有效抑制SPC-A1細胞的增殖。此外本研究結果還顯示，CA作用12、24、48、72 h時的IC30值分別為82.24、50.45、46.34、31.81 μg/mL，IC50值分別為108.06、73.35、70.08、49.89 μg/mL。綜合考慮上述結果，最終將Transwell遷移、蛋白質印跡、Real-time PCR試驗的CA低、中、高劑量均分別設置為50、75、100 μg/mL，將細胞轉染試驗的CA劑量設置為75 μg/mL，藥物的作用時間均確定為24 h。

Transwell遷移試驗結果顯示，CA各劑量組染色細胞數(shù)均較正常對照組顯著減少，且中、高劑量組顯著少于低劑量組，高劑量組顯著少于中劑量組；細胞遷移抑制率均較正常對照組顯著升高，且中、高劑量組顯著高于低劑量組，高劑量組顯著高于中劑量組。這提示CA能有效抑制SPC-A1細胞的遷移，且呈劑量依耐性。

腫瘤細胞增殖和遷移相關的生物學機制主要包括生長調控機制異常、細胞凋亡異常、細胞運動機制異常和細胞降解機制異常等[23]。PTEN是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有雙特異性磷酸水解酶功能的抑癌基因，對細胞內多條信號通路具有負性調節(jié)作用，與肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)展密切相關[24]。VEGF是重要的促血管生長因子，可誘導新生血管形成，從而促進腫瘤細胞的增殖、遷移[25]。MMP（尤其是MMP-9）也被證實在肺癌細胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮了重要的作用[26]。有研究指出，肺癌細胞中VEGF、MMP-9蛋白的表達水平是評價肺癌惡性程度的重要指標，也是PTEN參與調控的下游靶點[27]。miRNAs是廣泛存在于真核生物體內的內源性干擾RNA，其可通過與靶基因mRNA的3′端結合來發(fā)揮抑制靶基因表達的作用，從而參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程[28]。其中，miR-21與癌癥發(fā)生有關，且在多種人類腫瘤細胞中呈過表達[29]；miR-21表達的上調可造成抑癌基因PTEN的表達受到抑制，從而加速腫瘤的病理進展；此外，miR-21也被認為是評價肺癌惡性程度的重要指標之一，可用于患者的腫瘤惡性程度及其預后的評估[30-31]。基于以上理論，本研究初步探討了CA通過調控miR-21/PTEN信號通路抑制肺腺癌細胞侵襲和轉移的分子機制。結果顯示，CA中、高劑量組細胞中PTEN蛋白及其mRNA的相對表達量均較正常對照組顯著升高，且中、高劑量組顯著高于低劑量，高劑量組顯著高于中劑量組；CA低劑量組細胞中VEGF蛋白以及中、高劑量組細胞中VEGF、MMP-9蛋白及其mRNA的相對表達量均較正常對照組顯著降低，且中、高劑量組顯著低于低劑量組，高劑量組顯著低于低劑量組。這提示不同劑量的CA均可不同程度地上調PTEN蛋白及其mRNA的表達，下調VEGF、MMP-9蛋白及其mRNA的表達，且呈劑量依賴性。

為進一步驗證miR-21對PTEN表達的影響，本研究分別對SPC-A1細胞進行了miR-21 mimic、miR-21 inhibitor轉染，并考察了轉染后細胞中miR-21及PTEN、VEGF、MMP-9蛋白的表達情況。結果顯示，轉染miR- 21 mimic后，miR-21 mimic組細胞中miR-21及VEGF、MMP-9蛋白的相對表達量均顯著升高，PTEN的相對表達量顯著降低；加入CA干預后，細胞中miR-21及VEGF、MMP-9蛋白的相對表達量均較miR-21 mimics組顯著降低，PTEN的相對表達量顯著升高。轉染miR-21 inhibitor后，miR-21 inhibitor組細胞中miR-21及VEGF、MMP- 9蛋白的相對表達量均顯著降低，PTEN蛋白的相對表達量顯著升高；加入CA干預后，細胞中miR-21及上述蛋白的相對表達量較miR-21 inhibitor組均未發(fā)生顯著變化。這提示在miR-21過表達的SPC-A1細胞中，CA能明顯逆轉miR-21誘導的PTEN下調；而在miR-21低表達的SPC-A1細胞中，CA對PTEN表達無明顯調控作用，表明CA對肺腺癌SPC-A1細胞增殖、遷移的抑制作用可能是通過抑制miR-21表達、促進PTEN表達來實現(xiàn)的。

綜上所述，CA能抑制肺腺癌SPC-A1細胞的增殖和遷移，這種作用可能與調控miR-21/PTEN信號通路有關。本研究可為肺腺癌防治研究提供新的思路，但CA通過PTEN調控VEGF、MMP-9表達的具體機制仍有待于后續(xù)研究進一步確證。

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（收稿日期：2018-12-13 修回日期：2019-04-05）

（編輯：張元媛）