金琳 李海峰 劉衛(wèi)紅 胡侃

中圖分類號(hào) R282.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）03-0344-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.03.13

摘 要 目的：研究外源性茉莉酸甲酯對(duì)滇龍膽葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)（龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龍膽酯苷）含量及生理生化指標(biāo)的影響，為茉莉酸甲酯在滇龍膽規(guī)范化種植中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。方法：分別以10、50、100、200 mg/L茉莉酸甲酯噴施滇龍膽植株2、4、6、8、10 d（噴施量均為500 mL）后，收集藥材葉為樣品材料，并收集相應(yīng)時(shí)段未噴施處理的藥材葉為對(duì)照。采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定4個(gè)質(zhì)量濃度下茉莉酸甲酯噴施10 d后滇龍膽葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)含量，優(yōu)選茉莉酸甲酯的最佳噴施質(zhì)量濃度（有效成分含量最高）。采用HPLC法測(cè)定以最佳噴施質(zhì)量濃度茉莉酸甲酯噴施不同時(shí)間后滇龍膽葉4種裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)的含量，并測(cè)定其中相關(guān)生理生化指標(biāo)（超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶和丙二醛）水平。結(jié)果：以10、50、100、200 mg/L茉莉酸甲酯噴施滇龍膽植株10 d后，葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)的含量較未處理葉均不同程度增加，其中以100 mg/L茉莉酸甲酯噴施后效果最好，此時(shí)葉中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷的含量分別為未處理葉的1.88、2.36和1.87倍（P<0.05）。以100 mg/L茉莉酸甲酯噴施2、4、6、8、10 d后，葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)的含量均不同程度高于同時(shí)段未處理葉；在噴施4 d后葉中龍膽苦苷含量開(kāi)始出現(xiàn)顯著差異（P<0.05），在噴施6 d后葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)的含量總體較高，此時(shí)葉中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龍膽酯苷含量分別為同時(shí)段未處理葉的1.88、1.88、1.47、1.82倍（P<0.05）；并自噴施4 d起，葉中各生理生化指標(biāo)水平較未處理葉均顯著升高（P<0.05）。結(jié)論：以100 mg/L茉莉酸甲酯噴施6 d后滇龍膽葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)含量升高最明顯，這可能與其提高了葉中相關(guān)生理生化指標(biāo)的水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞 滇龍膽葉；高效液相色譜法；茉莉酸甲酯；裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)；含量測(cè)定；生理生化指標(biāo)

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of exogenous methyl jasmonate on the contents of 4 kinds of secoiridoid substance （gentiopicrin， swertiamain， sweroside and amarogentin） and biochemical indexes in the leaves of Gentiana rigescens， and to provide scientific evidence for the application of methyl jasmonate in standardized planting of G. rigescens. METHODS： 2， 4， 6， 8， 10 d after spraying 10， 50， 100， 200 mg/L methyl jasmonate （spraying amount was 500 mL） for G. rigescens strain， the leaves of medicinal material were collected as sample， and the other leaves without spraying methyl jasmonate were collected as control. HPLC method was used to determine the contents of 4 kinds of secoiridoid substance in the leaves of G. rigescens after spraying 4 kinds of concentrations of methyl jasmonate for 10 d. The concentration of methyl jasmonate was optimized （the content of effective component was the highest）. HPLC method was adopted to determine the contents of 4 kinds of secoiridoid substance in the leaves of G. rigescens after spraying the optimal concentration of methyl jasmonate for different time. The levels of relevant biochemical indexes （SOD， POD， CAT， MDA） were determined. RESULTS： 10 d after spraying 10， 50， 100， 200 mg/L methyl jasmonate for G. rigescens strains， the contents of 4 kinds of secoiridoid substance in the leaves were increased to different extent. Compared with untreated leaves， 100 mg/L methyl jasmonate had the best effect after spraying， and the contents of gentiopicrin， swertiamain and sweroside in treated leaves were 1.88， 2.36 and 1.87 times of those in untreated leaves， respectively （P<0.05）. 2， 4， 6， 8， 10 d after spraying 100 mg/L methyl jasmonate， the contents of 4 kinds of secoiridoid substance in treated leaves were higher than untreated leaves at corresponding stage； the content of secoiridoid had significant difference after spraying for 4 d （P<0.05）. The contents of active components in general were relatively high after spraying for 6 d， and the contents of gentiopicrin， swertiamain， sweroside and amarogentin in treated leaves were 1.88， 1.88， 1.47， 1.82 times of those in untreated leaves， respectively （P<0.05）. The levels of relevant biochemical indexes in treated leaves were increased significantly since 4 d of spraying， compared with untreated leaves （P<0.05）. CONCLUSIONS： After spraying 100 mg/L methyl jasmonate for 6 d， the contents increase of 4 kinds of secoiridoid substance in the leaves of G. rigescens are most obvious， which may be associated with improving the levels of related biochemical indexes.

KEYWORDS Leaves of Gentiana rigescens； HPLC； Methyl jasmonate； Secoiridoid substance； Content determination； Biochemical indexes

滇龍膽（Gentiana rigescens Franch.）又稱堅(jiān)龍膽、滇龍膽草，為龍膽科龍膽屬多年生宿根草本植物[1]，以根及根莖入藥，具有清熱瀉火、健脾、保肝等作用，主要用于治療黃疸、小兒疳熱、小便不利等癥，是龍膽瀉肝丸、龍膽注射液、小兒清熱片等200多種中成藥的原料藥之一[2-4]。滇龍膽是云南道地藥材，其次生代謝產(chǎn)物裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)（如龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龍膽酯苷等）為主要活性成分[5]，其中龍膽苦苷含量為2015年版《中國(guó)藥典》（一部）規(guī)定的龍膽藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)[1]，龍膽苦苷含量的高低直接影響藥材的品質(zhì)及藥用價(jià)值。從生物合成途徑來(lái)看，在滇龍膽葉綠體中，牻牛兒基二磷酸酯通過(guò)羥基化氧化成檸檬醛，再經(jīng)過(guò)環(huán)化、水合和還原形成臭蟻二醛，臭蟻二醛經(jīng)過(guò)烯醇化、羥醛縮合和苷化成環(huán)烯醚萜苷，環(huán)烯醚萜苷通過(guò)環(huán)斷裂、氧化內(nèi)酯化最終形成裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)[6]，故通過(guò)調(diào)節(jié)代謝途徑提高滇龍膽中主要活性成分的含量具有現(xiàn)實(shí)意義。

茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate）是一種新型植物激素，在植物體內(nèi)普遍存在，對(duì)一些重要的次生代謝過(guò)程起到調(diào)控作用[7]，目前已應(yīng)用于多種藥用植物（如三七[8]、茯苓[9]、苦玄參[10]、陽(yáng)春砂[11]等）中，均能夠誘導(dǎo)提高其相應(yīng)萜類化合物的含量。因此，本試驗(yàn)擬以遺傳性狀相同的滇龍膽組織培養(yǎng)苗為研究對(duì)象，在人工栽培條件下，通過(guò)葉面噴施的方法，探索經(jīng)不同質(zhì)量濃度茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后，滇龍膽葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)含量及相關(guān)生理生化指標(biāo)[超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）]水平的動(dòng)態(tài)變化，為采用茉莉酸甲酯提高大田栽培滇龍膽中主要活性成分含量提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜儀，包含G1313A ALS自動(dòng)進(jìn)樣器、G1315A/B二極管陣列檢測(cè)器、ChemStation色譜工作站（美國(guó)Agilent公司）；T6新世紀(jì)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；TGL-16C高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；AE240電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；SK5200H超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；Milli-Q Century系列純水處理系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

以同一植株滇龍膽誘導(dǎo)的遺傳性狀相同的組織培養(yǎng)苗為試驗(yàn)藥材（由大理大學(xué)藥物研究所李海峰教授鑒定為龍膽科龍膽屬滇龍膽植株）；龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、苦龍膽酯苷對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：分別為ZJ0701BA13、M29J4S1、PN1125- SA13、Z06J6S2，純度：均≥95%）；茉莉酸甲酯（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：24834483，純度：≥95%）；甲醇（美國(guó)Tedia公司，色譜純）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 滇龍膽葉樣品的準(zhǔn)備與處理

以大理州南澗縣樂(lè)秋鄉(xiāng)同一植株滇龍膽的越冬芽為外植株，經(jīng)叢生芽增殖途徑獲得滇龍膽組織培養(yǎng)苗，將組織培養(yǎng)苗栽培3年后，選取狀態(tài)良好、生長(zhǎng)一致的滇龍膽植株，分為5個(gè)組（4個(gè)處理組和1個(gè)對(duì)照組），每個(gè)組間相互間隔5 m，有植株120～140株。在植株開(kāi)花期分別用10、50、100和200 mg/L的茉莉酸甲酯各500 mL均勻噴灑在不同處理組的滇龍膽植株葉片2、4、6、8、10 d后，收集葉片，作為試驗(yàn)樣品；并收集相應(yīng)時(shí)段未噴施茉莉酸甲酯的植株（即對(duì)照組植株）葉片，作為對(duì)照。參照文獻(xiàn)方法[12]，將采集的處理和未處理滇龍膽葉片于50 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，將樣品粉碎，過(guò)100目篩，30 ℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量，用封口袋避光保存，備用。

2.2 滇龍膽葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 溶液的制備 （1）茉莉酸甲酯溶液。精密稱取茉莉酸甲酯400 mg，用少量無(wú)水乙醇溶解后加水制成質(zhì)量濃度為800 mg/L的母液；再精密吸取母液適量，加水稀釋成質(zhì)量濃度分別為10、50、100、200 mg/L的茉莉酸甲酯液[7]。（2）混合對(duì)照品溶液。精密稱取龍膽苦苷對(duì)照品1.9 mg、獐牙菜苦苷對(duì)照品1 mg、獐牙菜苷對(duì)照品0.5 mg和苦龍膽酯苷對(duì)照品0.5 mg，分別置于1、2、10和10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻。分別精密吸取0.4、0.1、0.16和0.16 mL上述4種溶液，置于同一1 mL量瓶中，用甲醇定容，制成龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龍膽酯苷質(zhì)量濃度分別為0.76、0.05、0.008和0.008 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存，待用。（3）供試品溶液。精密稱取藥材粉末0.1 g，置于10 mL量瓶中，加入2 mL甲醇，于40 ℃超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）處理20 min，濾紙過(guò)濾；濾渣用 2 mL甲醇按前述步驟重復(fù)處理1次，合并2次提取濾液至5 mL量瓶中，冷卻至室溫，加甲醇溶液充分混勻后定容，即得。

2.2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～15 min，15%→35%A；15～40 min，35%→80%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：龍膽苦苷為274 nm，獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龍膽酯苷均為243 nm；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 ?L。取“2.2”項(xiàng)下溶液（供試品溶液為未處理的對(duì)照樣品），在此色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，供試品圖譜中的特征峰與雜質(zhì)峰分離良好（分離度>1.5），理論板數(shù)按龍膽苦苷峰計(jì)不低于3 000。色譜圖見(jiàn)圖1。

2015年版《中國(guó)藥典》（一部）規(guī)定滇龍膽根及根莖為藥用部位[2]，而大理州白族民間長(zhǎng)期以滇龍膽全草入藥，這可能是因?yàn)榈猃埬懖煌课恢饕紊x產(chǎn)物存在差異，滇龍膽的主要活性成分裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)在葉中合成并進(jìn)行貯藏和分配[6]，且在花期中其葉、花中龍膽苦苷含量最高[14]。故本研究以開(kāi)花期滇龍膽組培苗為試驗(yàn)材料，通過(guò)葉面噴施茉莉酸甲酯，考察以不同質(zhì)量濃度處理不同時(shí)間后滇龍膽葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)含量的變化。研究結(jié)果表明，茉莉酸甲酯可顯著提高滇龍膽葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)含量，隨著質(zhì)量濃度和作用時(shí)間的升高或延長(zhǎng)，4種裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)含量基本上呈先升后降的趨勢(shì)，其中以100 mg/L茉莉酸甲酯處理6 d后的效果最佳。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在本試驗(yàn)條件下處理10 d后，葉中苦龍膽酯苷含量低于未處理葉，分析原因，這可能是由于茉莉酸甲酯促使植物產(chǎn)生了過(guò)多的植保素，對(duì)細(xì)胞自身的生長(zhǎng)產(chǎn)生毒性，不僅抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)也抑制了代謝物的積累所致[15]。

據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，經(jīng)茉莉酸甲酯處理后，菜豆[16]、錦繡杜鵑[17]、莧菜芽[18]等植物中相關(guān)酶活性增強(qiáng)，次生代謝產(chǎn)物含量增加。本研究發(fā)現(xiàn)，噴施茉莉酸甲酯4 d后，葉中SOD、POD、CAT活性及MDA的含量較未處理葉均顯著升高（P<0.05），基本上呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，且在第4～8天活性增幅明顯，與4種裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)含量的變化趨勢(shì)基本一致，這可能是由于POD、CAT等酶對(duì)外施茉莉酸甲酯產(chǎn)生脅迫的應(yīng)激反應(yīng)能在極短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生響應(yīng)，通過(guò)反饋調(diào)節(jié)使植物體內(nèi)自由基保持正常水平從而提高自身防御性，并迅速調(diào)整體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和次生代謝的方向[8]。因此，可以認(rèn)為茉莉酸甲酯處理滇龍膽葉片后，啟動(dòng)了滇龍膽的防御機(jī)制，導(dǎo)致這些防御反應(yīng)的關(guān)鍵酶活性/含量升高，參與了裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)的生物合成，最終促進(jìn)了滇龍膽裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)含量的升高。

綜上所述，通過(guò)葉面噴施茉莉酸甲酯，可以顯著提高滇龍膽葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)含量，其中以100 mg/L茉莉酸甲酯噴施6 d后效果最佳，該方法簡(jiǎn)單易行，可以在生產(chǎn)實(shí)踐中加以應(yīng)用，但有關(guān)茉莉酸甲酯促進(jìn)滇龍膽中4種裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)含量提高及防御酶的表達(dá)機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2018-09-18 修回日期：2018-12-05）

（編輯：林 靜）