王羽嬌，蔡 婧，葛淑華*

（1.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西安 710032；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系，西安 710032）

0 引言

臨床上頻繁使用高滲性藥物（如脫水藥、高滲糖、擴容劑等）進行靜脈輸注，是臨床診斷和醫(yī)療救治的重要手段[1]。臨床常用的高滲性藥物包括20%的甘露醇、10%的氯化鉀、50%的葡萄糖、25%的硫酸鎂等，這些藥物濃度高、刺激性強，在輸注后短時間內(nèi)會引起靜脈血管滲透壓的急劇升高，誘發(fā)血管中的炎癥細胞以及急劇脫水壞死的內(nèi)皮細胞發(fā)生堆積，引起血管內(nèi)膜萎縮、變硬及壞死，從而大概率導(dǎo)致化學(xué)性靜脈炎的發(fā)生[2-3]。靜脈炎能夠誘發(fā)患者產(chǎn)生局部腫脹、灼熱、疼痛甚至局部軟組織壞死等癥狀，增加病患痛苦并降低其生活質(zhì)量。探索有效防治高滲性藥物輸注誘發(fā)靜脈炎發(fā)生的醫(yī)學(xué)干預(yù)手段是目前臨床護理亟待解決的重要問題。從20世紀80年代開始，低強度脈沖電磁場開始廣泛應(yīng)用于臨床治療骨折延遲愈合和加速軟組織損傷修復(fù)[4-5]。同時，大量臨床研究表明低強度脈沖電磁場還具有顯著的對抗炎癥反應(yīng)和緩解疼痛的作用[6-7]。但是，低強度脈沖電磁場是否能夠?qū)o脈炎產(chǎn)生積極的治療效果，目前國內(nèi)外尚未見系統(tǒng)的研究證實。本研究通過建立新西蘭兔高滲性藥物靜脈炎模型，系統(tǒng)評價低強度脈沖電磁場刺激對于高滲性藥物注射誘發(fā)的靜脈炎的治療效果，以期明確低強度脈沖電磁場干預(yù)靜脈炎的可行性和科學(xué)性。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器和試劑

甘露醇，購于西安泰華醫(yī)藥科技有限公司；戊巴比妥鈉溶液，購于美國Sigma公司；電磁場空間測量高斯計（Model 455型），購于美國Lakeshore公司；TNF-α和IL-6的ELISA試劑盒，購于武漢華美生物工程有限公司；電子天平（AEG-120T），購于日本Shimadzu公司；紫外分光光度計（SmartSpec Plus），購于美國Bio-Rad公司；光學(xué)顯微成像系統(tǒng)，購于日本Olympus公司。

1.2 靜脈炎動物模型的構(gòu)建

選擇5月齡雌性新西蘭大耳白兔，體質(zhì)量（2.2±0.4）kg，購于空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，動物飼養(yǎng)和所有的實驗操作步驟均按照動物倫理學(xué)準則嚴格執(zhí)行。待動物適應(yīng)實驗室環(huán)境1周，隨后使用備皮刀進行物理方法備皮，操作過程中謹防傷及動物耳部表皮，備皮面積為3 cm×3 cm，使用龍膽紫溶液標(biāo)記。隨后，通過近心方向行靜脈穿刺，通過靜脈輸注20%的甘露醇溶液，用藥量為2.5 ml/kg，輸注5 min，靜脈推注過程中防止藥物外滲，整個過程嚴格執(zhí)行無菌操作。每天輸注2次，間隔8 h，連續(xù)輸注3 d。

1.3 脈沖電磁信號發(fā)生系統(tǒng)

使用課題組自行研制的脈沖電磁場發(fā)生系統(tǒng)，整個電磁發(fā)生系統(tǒng)由電磁信號激勵源和Helmholtz線圈兩部分構(gòu)成[8]。電磁信號激勵源以MSP430單片機為控制中心，通過與晶振的協(xié)同作用能夠輸出正弦波、三角波、脈沖波等各種波形的弱電信號，該弱電信號傳遞至OPA549功率放大芯片進行調(diào)制濾波和放大后轉(zhuǎn)換為高精度強電信號，隨后輸出至線圈負載。Helmholtz線圈由相互平行放置的間距40 cm的共軸圓形線圈構(gòu)成，兩線圈直徑均為80 cm，線圈匝數(shù)500。通過調(diào)整電磁信號發(fā)生系統(tǒng)的輸入電流參數(shù)，使Helmholtz線圈的中心軸線方向脈沖電磁場峰值達到2.0 mT，電磁場的頻率為15 Hz。使用高斯計測量電磁場的峰值也為2.0 mT，有效值為0.7 mT。低強度脈沖電磁場刺激過程中，將實驗動物置于塑料實驗籠內(nèi)，保證籠底與Helmholtz線圈中軸線在同一平面，保證動物受到的脈沖電磁場劑量均勻性最優(yōu)。使用高斯計測得的線圈外的環(huán)境背景磁場強度為（50±3）μT。在實驗全過程中，分別使用溫度計和濕度計對Helmholtz線圈中的環(huán)境溫度和相對濕度進行實時監(jiān)測，其中線圈中的溫度波動范圍為（23±0.5）℃，相對濕度變化范圍為（55±2）%。

1.4 實驗分組

整個實驗分為2組，分別為對照組和低強度脈沖電磁場刺激組，每組12只實驗兔。對照組的實驗兔只行靜脈炎動物模型的構(gòu)建處理，不施加脈沖電磁場刺激。低強度脈沖電磁場刺激組的實驗兔在行靜脈炎動物模型的構(gòu)建處理后，放入Helmholtz線圈中進行全身性的低強度脈沖電磁場刺激，每天刺激6 h，連續(xù)刺激3 d。對照組的實驗兔也放入Helmholtz線圈中，但是線圈不通以激勵電流。

1.5 靜脈炎的分級評估分析

靜脈炎的分級評估分析參考美國靜脈輸液護理學(xué)會靜脈炎程度判斷標(biāo)準（見表1）[9]，由一名專業(yè)的主管護師分別對對照組和低強度脈沖電磁場刺激組的實驗兔耳部特征進行觀察和評估分析（盲法判斷），判斷靜脈炎是否發(fā)生以及發(fā)生的等級程度。

1.6 血清細胞因子的檢測分析

在完成肉眼對靜脈炎發(fā)生等級的評估分析后，立即使用過量戊巴比妥鈉溶液對實驗兔進行麻醉，隨后通過心臟取血法獲得實驗兔全血，離心后獲得血清，使用ELISA試劑盒對實驗兔血清中的炎性相關(guān)因子TNF-α和IL-6的表達情況進行量化分析。ELISA檢測基于雙抗體夾心法原理，整個過程包括酶標(biāo)板包被、血清樣本上樣、加入酶標(biāo)抗體、加入底物液顯色、終止反應(yīng)以及酶標(biāo)儀吸光度檢測，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，取測量平均值。

表1 美國靜脈輸液護理學(xué)會發(fā)布的靜脈炎程度判斷標(biāo)準[9]

1.7 靜脈炎的病理學(xué)結(jié)構(gòu)分析

實驗兔處死后，迅速以靜脈穿刺點前1 cm作為起點，沿著靜脈走向剪取長度3 cm、寬度2 cm的耳部組織，浸入4%多聚甲醛中固定24 h，隨后進行組織病理切片，行常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下對實驗兔血管內(nèi)皮腫脹、血管外周組織水腫、炎細胞浸潤、血栓形成等靜脈炎的病理學(xué)結(jié)構(gòu)特征進行系統(tǒng)評估和分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)比較和分析。各組實驗兔測量指標(biāo)的統(tǒng)計學(xué)差異使用配對t檢驗進行比較分析，P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 通過肉眼觀察分析評估低強度脈沖電磁場刺激對實驗兔靜脈炎的作用效果

對照組和低強度脈沖電磁場刺激組實驗兔的靜脈炎程度以及靜脈炎發(fā)生率的分析比較結(jié)果見表2。對照組實驗兔全部發(fā)生了靜脈炎，其中1～2級靜脈炎的發(fā)生率為25.0%，3～4級靜脈炎的發(fā)生率為75.0%。低強度脈沖電磁場刺激組實驗兔的靜脈炎發(fā)生率為41.7%，顯著低于對照組（P＜0.05），其中 1～2級靜脈炎的發(fā)生率為33.3%，3～4級靜脈炎的發(fā)生率為8.3%。

表2 低強度脈沖電磁場刺激對實驗兔靜脈炎的作用效果（n=12）

2.2 通過ELISA檢測評估低強度脈沖電磁場刺激對實驗兔血清炎性因子分泌的調(diào)控效果

對照組和低強度脈沖電磁場刺激組實驗兔的血清炎性因子TNF-α和IL-6表達分泌的分析比較結(jié)果如圖1所示。與對照組的實驗兔相比，低強度脈沖電磁場刺激組實驗兔血清中TNF-α的含量顯著降低（P＜0.05），IL-6 的含量也顯著降低（P＜0.01），表明低強度脈沖電磁場刺激對于靜脈炎動物模型機體的炎性因子的表達分泌具有顯著的抑制效果，進一步證實了低強度脈沖電磁場刺激具有顯著的抗炎效應(yīng)。

圖1 低強度脈沖電磁場刺激對靜脈炎實驗兔血清炎性因子表達分泌的影響（n=12）

2.3 通過病理結(jié)構(gòu)分析評估低強度脈沖電磁場刺激對實驗兔靜脈炎及外周組織損傷的作用效果

通過病理結(jié)構(gòu)切片染色分析對照組和低強度脈沖電磁場刺激組實驗兔的靜脈炎和外周組織損傷的代表性組織病理圖以及數(shù)據(jù)分析比較結(jié)果分別如圖2和表3所示。對照組實驗兔血管內(nèi)皮腫脹、血管外周水腫、炎細胞浸潤、血栓形成的發(fā)生率分別為75.0%、66.7%、83.3%和66.7%，而低強度脈沖電磁場刺激組實驗兔血管內(nèi)皮腫脹、血管外周水腫、炎細胞浸潤、血栓形成的發(fā)生率分別為33.3%、25.0%、16.7%和0%，均顯著低于對照組（P＜0.05）。

表3 低強度脈沖電磁場刺激對實驗兔靜脈炎及外周組織損傷的作用效果（n=12）例

圖2 對照組和低強度脈沖電磁場刺激組代表性的實驗兔靜脈及外周組織病理切片圖（HE染色，10×）

3 討論

靜脈炎是臨床最為常見的疾病之一，也是臨床護理最普遍發(fā)生和棘手的醫(yī)學(xué)問題。當(dāng)靜脈輸注高濃度、高滲性、強刺激性的藥物時會誘發(fā)化學(xué)性靜脈炎，而隨著靜脈留置針的普遍使用以及由于操作不當(dāng)引起的機械系損傷和不規(guī)范無菌操作等也會引起靜脈炎的產(chǎn)生[10]。因此，探尋有效的防治靜脈炎的醫(yī)學(xué)方法也是目前臨床護理關(guān)注的重要問題。近年來，隨著生物電磁技術(shù)的快速發(fā)展，基于電磁場的治療方法和電磁生物效應(yīng)也得到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。電磁場的發(fā)生方式有多種，最為常見的包括穩(wěn)恒磁場、正弦波電磁場和脈沖電磁場[11]，而這其中國際上對機體的積極干預(yù)效果報道最多的治療模式就是脈沖電磁場[12-15]。大量研究表明，低強度脈沖電磁場能夠有效治療機體硬組織和軟組織的創(chuàng)傷延遲愈合，提高組織損傷的修復(fù)能力[12，16]。同時，學(xué)者們也發(fā)現(xiàn)了低強度脈沖電磁場能夠改善機體的局部微循環(huán)障礙，并具有對抗機體炎癥反應(yīng)和緩解疼痛的功能[17]。這些關(guān)于低強度脈沖電磁場的研究進展為開展靜脈炎的電磁干預(yù)研究提供了充分的理論依據(jù)。

本研究通過靜脈注射20%的甘露醇構(gòu)建了化學(xué)性靜脈炎動物模型。臨床上，通常要求在30min內(nèi)完成20%的甘露醇的快速靜脈輸注，從而達到良好的脫水效果。但是20%的甘露醇的高滲性會造成血管內(nèi)皮細胞脫水、萎縮和凋亡，并出現(xiàn)炎性細胞的浸潤以及靜脈血管栓塞的發(fā)生，引起化學(xué)性靜脈炎[18]。本研究發(fā)現(xiàn)20%的甘露醇靜脈輸注能夠誘發(fā)全部實驗兔發(fā)生靜脈炎，且其中3~4級靜脈炎發(fā)生率高達75.0%，提示化學(xué)性靜脈炎動物模型構(gòu)建成功。病理學(xué)分析結(jié)果也顯示，在經(jīng)過20%的甘露醇靜脈輸注后，絕大多數(shù)實驗兔出現(xiàn)了血管內(nèi)皮腫脹、血管外周水腫、炎細胞浸潤和血栓形成，這與臨床化學(xué)性靜脈炎的特征相符。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過低強度脈沖電磁場干預(yù)后，20%的甘露醇靜脈輸注的實驗兔靜脈炎發(fā)生率降低至33.3%，并且3~4級靜脈炎的發(fā)生率降低至8.3%，表明低強度脈沖電磁場治療能夠顯著地抑制化學(xué)性靜脈炎的發(fā)生和發(fā)展。同時也揭示了經(jīng)過低強度脈沖電磁場刺激后實驗兔的血管內(nèi)皮腫脹、血管外周水腫、炎細胞浸潤和血栓形成等靜脈炎癥狀均被顯著抑制。這些結(jié)果提示低強度脈沖電磁場對于靜脈炎的作用效果與其提高血管內(nèi)皮細胞活性、改善機體局部微循環(huán)以及對抗機體炎癥反應(yīng)具有潛在相關(guān)關(guān)系。

TNF-α是由單核巨噬細胞產(chǎn)生的具有免疫調(diào)節(jié)功能和參與炎癥反應(yīng)的重要細胞因子，而IL-6屬于多效應(yīng)細胞調(diào)控因子，是參與調(diào)控機體免疫應(yīng)答反應(yīng)的重要介質(zhì)。研究表明，在靜脈炎機體血液中的TNF-α和IL-6的含量均顯著性升高[19]。本研究通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過脈沖電磁場刺激后20%的甘露醇誘發(fā)的靜脈炎實驗兔血液中TNF-α和IL-6含量均顯著低于對照組。進一步揭示了低強度脈沖電磁場表現(xiàn)出顯著的緩解機體炎癥反應(yīng)和對抗炎性因子浸潤的作用效果，這也為明確低強度脈沖電磁場調(diào)控高滲性藥物注射誘發(fā)的化學(xué)性靜脈炎的作用機理提供了重要依據(jù)。

綜上所述，本研究通過特征觀察、病理性分析、血液ELISA檢測證實了外源性施加低強度脈沖電磁場刺激能夠有效地抑制靜脈注射甘露醇誘發(fā)的化學(xué)性靜脈炎的發(fā)生和發(fā)展。低強度脈沖電磁場憑借其非侵入、安全、溫和的獨特優(yōu)勢，具有臨床治療靜脈炎的廣闊應(yīng)用前景。在未來的研究中，我們將進行不同強度和頻率脈沖電磁場對于靜脈炎作用效果的系統(tǒng)比較，以期篩選獲得脈沖電磁場對于靜脈炎防治的最優(yōu)“窗口參數(shù)”。另外，將以脈沖電磁場對于細胞炎性反應(yīng)信號通路事件為突破口，通過協(xié)同以基因轉(zhuǎn)染和基因干擾等分子生物學(xué)方法進一步闡明低強度脈沖電磁場對于靜脈炎防治的潛在分子信號機制，以期為其更科學(xué)、廣泛地應(yīng)用于臨床奠定堅實的基礎(chǔ)。