董紅敬，姚雪，穆巖，馬雙雙，耿巖玲，劉峰，劉偉*，張渝潔

(1. 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省分析測試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355，3. 臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276005)

黃芩為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，主要分布于我國的河北、遼寧、山西、山東等地，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芩中化學(xué)成分具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性[2-3]。中藥的藥理作用是多種化學(xué)成分對機(jī)體綜合作用的結(jié)果，然而目前關(guān)于黃芩藥理作用及機(jī)制的研究多是針對其中的單一化學(xué)成分，這對其中藥作用機(jī)制的闡明有一定的局限性[4]。

隨著系統(tǒng)生物學(xué)、分子生物學(xué)以及計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和整合藥理學(xué)等前沿方法被廣泛地應(yīng)用于中藥領(lǐng)域的各項(xiàng)研究[5-7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法可以通過分析化合物與靶點(diǎn)之間的關(guān)系間接地說明化合物與疾病的關(guān)系，從而闡明中藥中多種化合物對機(jī)體的整體作用[8-9]。這種研究方法與中醫(yī)的整體觀、辨證論治、協(xié)同配伍等原則類似，對于中藥傳統(tǒng)功效的生物功能闡釋及藥效成分(群)的發(fā)現(xiàn)具有重要的指導(dǎo)意義[10]。本研究采用高效液相色譜-電噴霧-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(HPLC-ESI-Q-TOF MS)對黃芩水煎液中的化學(xué)成分進(jìn)行了識(shí)別，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對黃芩中相對含量較高的化合物的作用靶點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測，并對相關(guān)疾病及其作用機(jī)制進(jìn)行了挖掘，以期為黃芩傳統(tǒng)功效的作用機(jī)制研究提供參考。

1 儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)、布魯克Impact II高分辨質(zhì)譜儀(德國布魯克公司)；色譜純乙腈(天津市康科德科技有限公司)、色譜純甲酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠)、純水(美國密理博Millipore Direct-Q8超純水機(jī)制備)；黃芩飲片(河北楚風(fēng)中藥飲片有限公司)。

2 方法

2.1 黃芩水煎液中化合物數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

按照本課題組前期建立的黃芩標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法制備樣品溶液[11]，利用Q-TOF MS技術(shù)可為液相色譜峰提供精確分子量，該技術(shù)具有可對色譜峰進(jìn)行定性的優(yōu)勢，采用HPLC-ESI-Q-TOF MS技術(shù)對黃芩標(biāo)準(zhǔn)湯劑中主要共有峰進(jìn)行定性鑒別[11]。液相條件：流動(dòng)相為乙腈(A)和0.1%甲酸水溶液(B)；梯度為0～20 min，15%～25%A；20～35 min，25%～30%A；35～50 min，30%～50%A；50～65 min，50%～85%A；流速為0.8 mL/min；柱溫為30 ℃。質(zhì)譜條件：采集模式為正離子檢測模式；干燥氣體積流量為8 L/min；毛細(xì)管電壓為3500 V；質(zhì)荷數(shù)(m/z)掃描范圍為50～1000。

提取色譜峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，獲得色譜峰對應(yīng)化合物的精確分子量，得到化合物的分子式，并通過與文獻(xiàn)進(jìn)行對比，對化合物進(jìn)行定性分析，獲得黃芩水煎液中化學(xué)成分[12]。通過ChemSpider網(wǎng)站[13]查詢化合物并下載化合結(jié)構(gòu)式，采用ChemBioDraw Ultra(14.0)軟件提取出化合物的SMILS文件，用于化合物靶點(diǎn)預(yù)測。

2.2 預(yù)測化合物的靶點(diǎn)

在網(wǎng)絡(luò)中，與節(jié)點(diǎn)相連的路線條數(shù)可以用度來表示，度值越大，靶點(diǎn)與化合物的作用關(guān)系越密切，也可能是化合物的關(guān)鍵靶點(diǎn)[5]。采用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫[14]對黃芩標(biāo)準(zhǔn)湯劑中主要化學(xué)成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(人源靶點(diǎn))。采用Cytoscape(3.5.1)軟件繪制化合物-靶點(diǎn)(compound-target，C-T)網(wǎng)絡(luò)圖，并對其拓?fù)涮匦赃M(jìn)行分析，篩選出度值≥2的靶點(diǎn)。

2.3 構(gòu)建靶標(biāo)-疾病網(wǎng)絡(luò)

采用CTD數(shù)據(jù)庫[15]對度值≥2的靶點(diǎn)進(jìn)行分析，查找與靶點(diǎn)相關(guān)的疾病，從而間接獲取黃芩中化學(xué)成分與疾病之間的關(guān)系。本研究選取推理得分≥100的疾病名稱，推理得分越高，說明疾病與靶點(diǎn)之間的關(guān)系越可靠。

2.4 通路富集分析

利用DAVID(the database for annotation, visualization and integrated discovery)數(shù)據(jù)庫[16]對相關(guān)靶點(diǎn)的通路進(jìn)行富集分析，選擇P<0.05的生物通路，采用Cytoscape繪制靶點(diǎn)-生物通路(targets-pathways, T-P)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，分析靶點(diǎn)與生物通路的關(guān)系。整合C-T和T-P數(shù)據(jù)，構(gòu)建主要活性成分-生物通路(C-P)作用網(wǎng)絡(luò)，并分析成分和通路的關(guān)系，可從分子水平闡明黃芩中多種成分對治療疾病的相互作用關(guān)系。

3 結(jié)果與分析

3.1 黃芩水煎液中化學(xué)成分的識(shí)別

圖1為黃芩標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC-ESI-Q-TOF MS基峰圖，顯示主要有8個(gè)色譜峰，通過質(zhì)譜提供的化合物分子量信息，并與參考文獻(xiàn)比較，總共鑒定了8個(gè)化合物，分別為Baicalin、Glychionide A、Oroxylin A 7-O-β-D-glucoside、Wogonoside、Baicalein、Wogonin、Scullcapflavone II、Oroxylin A[12]。化合物具體信息如表1所示。

圖1 黃芩水煎液HPLC-ESI-Q-TOF MS基峰圖Fig.1 Base peak chromatogram of Scutellaria baicalensis Georgi decoction analyzed by HPLC-ESI-Q-TOF MS

表1 黃芩水煎液中化合物具體信息

續(xù)表1

3.2 黃芩主要化學(xué)成分的潛在靶點(diǎn)反向虛擬篩選

將8個(gè)化合物結(jié)構(gòu)式分別投入到Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫[14]，進(jìn)行作用靶點(diǎn)的反向虛擬篩選，共匹配得到44個(gè)潛在靶點(diǎn)。使用Cytoscape軟件繪圖，得到C-T相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。該網(wǎng)絡(luò)共有52個(gè)節(jié)點(diǎn)，包含8個(gè)化學(xué)成分和44個(gè)靶點(diǎn)蛋白，組成120條化合物-靶點(diǎn)關(guān)系。該網(wǎng)絡(luò)描述了化合物-靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，解釋了黃芩多種化學(xué)成分潛在藥理作用的相互作用關(guān)系(節(jié)點(diǎn)和邊分別表示化合物和靶點(diǎn)及其之間的作用關(guān)系)。如表2所示，C-T相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖中，度值>5的靶點(diǎn)有7個(gè)，分別為PTGS1(前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1)、PTGS2(前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2)、TDP1(酪氨酰-DNA磷酸二酯酶1)、ADORA1(腺苷A1受體基因)、AKR1B10(醛糖還原酶相似蛋白1)、AKR1B15(醛糖還原酶1B15)、AKR1B1(醛糖還原酶)。研究表明，PTGS1和PTGS2與動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥、腦卒中有密切的關(guān)系[17]；TDP1是治療腫瘤的潛在靶點(diǎn)[18]；ADORA1是缺血性腦損傷修復(fù)及炎癥、鎮(zhèn)痛的靶點(diǎn)[19-20]；AKR1B10是腫瘤、乙肝病毒的靶點(diǎn)，并且具有代謝毒性醛酮物質(zhì)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成的功能[21]。以上研究說明，中藥黃芩具有治療疾病多靶點(diǎn)、多種藥理活性的特點(diǎn)。

圖2 黃芩中化合物-靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The compound-target network of Scutellaria baicalensis Georgi

表2 度值大于5的靶點(diǎn)

3.3 黃芩主要化學(xué)成分的潛在靶點(diǎn)與疾病的相互關(guān)系

通過CTD在線分析平臺(tái)篩選度值大于等于2靶點(diǎn)蛋白相關(guān)疾病，繪制T-D關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖(圖3，度值大于等于8)，度值越大說明靶點(diǎn)與疾病之間的關(guān)系越密切。T-D網(wǎng)絡(luò)中共包含38個(gè)節(jié)點(diǎn)，包括13個(gè)靶點(diǎn)，涉及25種疾病，主要有化學(xué)以及藥物誘導(dǎo)的肝損傷(chemical and drug induced liver injury)、體重減輕(weight loss)、炎癥(inflammation)、增生(hyperplasia)、壞死(necrosis)、纖維化(fibrosis)、產(chǎn)前暴露遲發(fā)效應(yīng)(prenatal exposure delayed effects)、腎病(kidney diseases)、水腫(edema)、中毒(poisoning)、高血壓(hypertension)、學(xué)習(xí)障礙(learning disorders)、記憶障礙(memory disorders)、肝腫大(hepatomegaly)、神經(jīng)損傷(nerve Degeneration)、認(rèn)知障礙(cognition disorders)、藥物相關(guān)副作用和不良反應(yīng)(drug-related side effects and adverse reactions)、微核染色體缺陷(micronuclei, chromosone-defective)、腫瘤(neoplasms)、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化(cell transformation, neoplastic)、肝臟腫瘤(liver neoplasms)、蛋白尿(proteinuria)、動(dòng)物疾病 (animal disease models)、出血(hemorrhage)和心臟病(heart disease)。

以上結(jié)果表明，黃芩的8種黃酮類成分可以靶向多種疾病的相關(guān)蛋白，展現(xiàn)了廣泛的藥理活性，主要涉及到血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、肝臟、腎臟等相關(guān)疾病，這與黃芩的現(xiàn)代藥理活性實(shí)驗(yàn)研究基本一致[22-28]。同時(shí)，經(jīng)過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，發(fā)現(xiàn)黃芩黃酮類成分可以靶向出血性疾病的相關(guān)蛋白，預(yù)測黃芩可能對出血性疾病具有潛在的療效，這與傳統(tǒng)上認(rèn)為的黃芩的止血功效有一定的相關(guān)性，但目前關(guān)于黃芩止血活性的研究報(bào)道較少。因此，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法可為傳統(tǒng)藥物的功效提供現(xiàn)代醫(yī)學(xué)闡釋，可為黃芩新的藥理作用機(jī)制及其有效成分的發(fā)現(xiàn)提供理論指導(dǎo)。

圖3 黃芩中化學(xué)成分靶點(diǎn)-疾病關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 3 The target-disease (T-D)network of chemical constituents in Scutellaria baicalensis Georgi

3.4 生物功能富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對度值≥8的T-P網(wǎng)絡(luò)中涉及的13個(gè)靶點(diǎn)蛋白在信號(hào)通路中的作用進(jìn)行了KEGG通路富集分析，共得到了12條信號(hào)通路，其中P<0.05有6條(圖4)，包括代謝通路(Metabolic pathways)、脂肪細(xì)胞代謝通路(Regulation of lipolysis in adipocytes)、花生四烯酸代謝(Arachidonic acid metabolism)、5-羥色胺突觸(Serotonergic synapse)、精氨酸生物合成(Arginine biosynthesis)、鈣離子信號(hào)通路(Calcium signaling pathway)。研究證實(shí)，黃芩水煎液可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)物質(zhì)的代謝治療肥胖和高甘油三酯血癥[25,29];通過調(diào)節(jié)精氨酸生物合成，從而抑制NO的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎活性[24]；黃芩素可通過增加體內(nèi)5-羥色胺的含量發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的活性;通過調(diào)節(jié)鈣離子信號(hào)通路防止心肌細(xì)胞的損傷[30-31]。綜上所述，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測的部分結(jié)果與現(xiàn)在已經(jīng)報(bào)道的研究機(jī)制一致，證明了此方法預(yù)測的可靠性，同時(shí)也說明黃芩水煎液中化學(xué)成分可作用于多個(gè)靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)體內(nèi)多個(gè)生物合成和代謝信號(hào)通路，從而達(dá)到治療多種疾病的作用。

圖4 黃芩中化學(xué)成分靶點(diǎn)-通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 4 The T-P network of the chemical constituents in Scutellaria baicalensis Georgi

4 討論

本研究采用HPLC-ESI-Q-TOF MS對黃芩標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的化學(xué)成分進(jìn)行識(shí)別，發(fā)現(xiàn)黃芩水煎液中主要含有8個(gè)黃酮類化學(xué)成分。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對8種黃酮類成分的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)黃芩除了與已報(bào)道的抗炎、抗腫瘤等疾病相關(guān)，還與水腫、中毒、高血壓、出血、心臟病等多種疾病相關(guān)，這與黃芩傳統(tǒng)功效的瀉火解毒、止血的功效相近。進(jìn)一步對靶點(diǎn)的信號(hào)通路進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)了12條相關(guān)信號(hào)通路，表明黃芩中化學(xué)成分具有多靶點(diǎn)、多通路的藥理作用特點(diǎn)。該研究為黃芩整體藥理作用及機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。