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        UPE-HILIC-DAD-ESI-TOF/MS法測定山東產(chǎn)區(qū)丹參中丹酚酸類成分

        2019-10-18 01:04:16東莎莎程素盼馬天宇劉偉張渝潔王曉劉代成趙恒強(qiáng)
        山東科學(xué) 2019年5期

        東莎莎,程素盼,馬天宇,劉偉,張渝潔,王曉,劉代成,趙恒強(qiáng)*

        (1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院),山東省分析測試中心,山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250014;2.中華全國供銷合作總社濟(jì)南果品研究院,山東 濟(jì)南 250014; 3.臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 臨沂 276005; 4.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250014)

        丹參系唇形科鼠尾草屬植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰之功效[1-3]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,丹參中丹酚酸類成分有明顯的抑制血小板聚集、抗凝血及降低血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用,能縮小心肌梗死的范圍,減輕病情,具有較大的臨床藥用價(jià)值,廣泛用于臨床各種心血管疾病的治療[4-5]。2015版《中國藥典》將丹酚酸類的丹酚酸B作為質(zhì)控指標(biāo)[1]。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),單一的指標(biāo)成分不能全面反映中藥的質(zhì)量。因此,丹參中丹酚酸類、多成分的同時(shí)分析測定是提升丹參藥材質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的必然要求。

        目前,丹參中丹酚酸類成分主要采用超聲和水浴回流法提取[1,6-7],用反相色譜法進(jìn)行分析。超聲提取法在提取過程中由于其熱效應(yīng)會(huì)造成提取溶劑溫度升高,水浴回流提取本身采用溶劑加熱、蒸發(fā)、冷凝回流方式提取,而丹參酚酸類成分本身是熱不穩(wěn)定成分,兩種提取方式不可避免會(huì)造成目標(biāo)物一定程度的分解,影響最終測定結(jié)果準(zhǔn)確性。另外,丹參中丹酚酸類成分在反相色譜柱上保留較差,為提高保留效果,一般采用高比例水相進(jìn)行洗脫,然而高比例水相會(huì)影響色譜柱使用壽命,同時(shí)與質(zhì)譜的兼容性較差。因此,發(fā)展探究丹參中丹酚酸類、多成分的準(zhǔn)確、高效提取和對色譜、質(zhì)譜兼容性好的分析方法具有重要意義。

        超高壓(ultrahigh pressure extraction, UPE)提取技術(shù)是近年來新發(fā)展的一種高效提取技術(shù),利用100 MPa以上的流體靜壓力作用于溶劑和中藥的混合液,保壓一段時(shí)間后卸壓,因其內(nèi)外壓差驟變使細(xì)胞破裂,有效成分釋放出來,從而達(dá)到提取的目的。該方法與超聲波輔助提取法和水浴回流提取法相比有提取率高、提取時(shí)間短、能耗低、純度高[8-10]等優(yōu)點(diǎn),并且避免了因熱效應(yīng)引起的有效成分結(jié)構(gòu)變化、損失以及生理活性的降低。目前,該技術(shù)在天然化學(xué)成分提取中的應(yīng)用越來越廣泛,已成功提取了黃酮、皂苷、生物堿、茶多酚等多種中藥化學(xué)成分[11]。親水色譜(HILIC)是一種新型色譜分離技術(shù),其采用強(qiáng)極性材料作為固定相,對極性和水溶性成分保留較好;以高比例的乙腈作為有機(jī)相,與質(zhì)譜兼容性較好;與電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜(ESI-TOF/MS)聯(lián)用可以實(shí)現(xiàn)對極性成分的良好分離和鑒別。目前,該技術(shù)在天然產(chǎn)物極性成分分析中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[12-16]。

        本研究建立了UPE-HILIC-DAD-ESI-TOF/MS提取和分析測定丹參中丹酚酸類成分的方法,并用于山東產(chǎn)區(qū)丹參藥材中丹酚酸類成分的測定,研究結(jié)果將為丹參中丹酚酸類多成分的高效提取和分析測定提供技術(shù)支持。

        1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

        1.1 儀器與試劑

        1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司),配有二極管陣列(DAD)檢測器,四元泵,柱溫箱,自動(dòng)進(jìn)樣器等;Agilent 6520 Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司);HPP·L3-600型超高壓生物提取設(shè)備(天津市華泰森淼有限公司);KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司);Milli-Q(18.2 MΩ)超純水處理系統(tǒng)(美國Millipore公司);THZ-8恒溫水浴鍋(中國浙江嘉興電熱儀器廠)。

        XBridge Amide色譜柱(4.6 mm×250 mm,3.5 μm,美國Waters);Merck SeQuant ZIC-HILIC色譜柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm,德國Merck) ;XBridge HILIC色譜柱(2.1 mm×150 mm, 3.5 μm,美國Waters)。

        甲醇、乙腈(色譜純,美國Fisher Scientific);甲酸、乙酸銨、甲酸銨(色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);其余試劑均為分析純,水為自制Milli-Q超純水。

        1.2 樣品的收集與處理

        本研究所采用的丹參樣品均采自濟(jì)南各大藥店以及不同種植基地,采集時(shí)間為2011年至2012年,采集12個(gè)不同批次的樣品,經(jīng)山東省分析測試中心王曉研究員鑒定為正品丹參SalviamiltiorrhizaeBge.,所采集到的樣品詳細(xì)信息見表1。丹參樣品置于烘箱中55 ℃鼓風(fēng)干燥4 h。干燥后粉碎,過40目篩子,混合均勻,制備成丹參干粉樣品,密閉、避光、干燥、常溫貯藏。

        表1 丹參藥材來源

        2 方法與結(jié)果

        2.1 供試品溶液的制備

        2.1.1 超高壓提取法

        a 提取溶劑 b 料液比 c 提取時(shí)間

        2.1.2 超聲波輔助提取法

        2.1.3 水浴回流提取法

        不同提取方式下的色譜圖見圖2。

        圖2 不同提取方式下的色譜圖Fig.2 Chromatograms of samples prepared using different extraction methods

        2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

        分別精密稱取丹酚酸A、迷迭香酸、原兒茶醛、原兒茶酸、熊果酸、紫草酸、丹酚酸B對照品各1.0 mg,置于1 mL量瓶中,用去離子水定容至刻度線,配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的對照品儲(chǔ)備溶液,保存?zhèn)溆?。精密吸取各對照品?chǔ)備液適量于1 mL容量瓶中,加去離子水定容至刻度,配成含丹酚酸B 50 μg/mL,含其余標(biāo)準(zhǔn)品40 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合對照品溶液,保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.3 色譜條件

        XBridge Amide色譜柱(4.6 mm×250 mm,3.5 μm),流動(dòng)相A:0.8%甲酸、20 mmol/L甲酸銨、30%乙腈、10%正丁醇的水溶液,流動(dòng)相B:乙腈(含0.8%甲酸),流速為0.8 mL/min,柱溫25 ℃,檢測波長280 nm,進(jìn)樣量20 μL,洗脫程序?yàn)門:0-5-12-17-23-27-35-40-43-50-55-57-60-62 min,B%:94%-94%-92%-90%-89%-88%-87%-86%- 86%-85%-60%-50%-45%-20%。優(yōu)化后的色譜圖見圖3。

        圖3 丹參HILIC-DAD(280 nm)色譜圖Fig.3 HILIC-DAD (280 nm) chromatogram of Danshen

        2.4 質(zhì)譜條件

        ESI-MS工作條件如下:負(fù)離子電離模式,霧化氣壓力45 psi,干燥氣(N2)流速10.0 L/min,干燥氣體溫度340 ℃,毛細(xì)管電壓4300 V,裂解電壓100 V,錐孔電壓60 V,全掃描(Scan)質(zhì)荷比(m/z)為50~1000。樣品的總離子流圖見圖4,質(zhì)譜鑒別結(jié)果見表2。

        圖4 丹參HILIC-ESI-TOF/MS 總離子流Fig.4 TIC chromatogram of HILIC-ESI-TOF/MS of Danshen

        表2 丹參提取物中7個(gè)化合物的HILIC-ESI-TOF/MS測定結(jié)果

        2.5 方法學(xué)考察

        2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測限

        按2.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析,測定各不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液中各化合物的峰面積,以各化合物濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并求得回歸方程。將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至低濃度進(jìn)樣,以3倍信噪比計(jì)算各丹酚酸類成分的檢測限,以10倍信噪比計(jì)算定量限,結(jié)果見表3。

        表3 7種酚酸HILIC分析回歸方程、線性范圍等結(jié)果

        2.5.2 精密度

        按2.3節(jié)色譜條件,對同一供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次測定,分別測得7個(gè)色譜峰的峰面積和保留時(shí)間,分別計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。7個(gè)色譜峰峰面積和保留時(shí)間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.26%~3.79%和0.31%~2.25%,表明儀器精密度良好。

        2.5.3 重復(fù)性

        精密稱取同一丹參樣品6份,按2.1供試品溶液制備方法進(jìn)行處理,按照2.3節(jié)色譜工作條件進(jìn)樣分析,測得7個(gè)色譜峰的峰面積和保留時(shí)間,并計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,7個(gè)色譜峰峰面積和保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.59%~4.43% 和1.31%~2.21%,表明該方法重復(fù)性良好。

        2.5.4 穩(wěn)定性

        將供試品溶液按照2.3節(jié)色譜工作條件,分別在0、1、3、6、12、24 h進(jìn)樣測定,結(jié)果顯示,7個(gè)色譜峰峰面積和保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.48%~3.25%和0.72%~2.48%,說明供試品溶液在24 h內(nèi)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

        2.5.5 加標(biāo)回收率

        精密稱取已知各目標(biāo)化合物含量的丹參樣品0.50 g,分別準(zhǔn)確加入丹酚酸A、迷迭香酸、原兒茶醛、原兒茶酸、熊果酸、紫草酸、丹酚酸B對照品適量,按照供試品溶液制備方法處理6 份,按上述色譜條件進(jìn)樣分析,測定各目標(biāo)化合物峰面積,計(jì)算平均加樣回收率(n= 6)分別為92.1%、95.7%、98.7%、102.7%、99.2%、95.8%、94.7%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.43%、2.79%、4.17%、3.36%、3.18%、2.53%及3.57%。

        2.6 樣品測定

        采用2.1節(jié)供試品溶液制備方法制備樣品溶液,采用2.3節(jié)色譜條件分別進(jìn)樣分析,獲得12批丹參樣品中7種丹酚酸類化合物色譜峰面積,將測得結(jié)果帶入表3的線性回歸方程,計(jì)算丹參樣品中各丹酚酸類化合物的含量(表4)。

        表4 丹參中7種丹酚酸類化合物含量測定結(jié)果(n=3)

        續(xù)表4

        從表4 可以看出,12批山東產(chǎn)區(qū)丹參樣品中7種丹酚酸類成分含量以丹酚酸B含量最高,其平均值達(dá)到(38.725±5.464)mg/g;原兒茶醛的含量最低,其平均值達(dá)到(0.124±0.011)mg/g;7種丹酚酸類成分總含量為(45.714±5.537)mg/g。7種丹酚酸類成分含量由大到小依次為丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、原兒茶酸、丹酚酸A、熊果酸、原兒茶醛。

        3 討論

        3.1 提取條件優(yōu)化

        本研究采用單因素試驗(yàn)對超高壓提取條件進(jìn)行了優(yōu)化??疾炝瞬煌崛∪軇?水、20%甲醇、40%甲醇)對丹參水提物的提取效果(圖1a),結(jié)果表明,用20%甲醇作提取溶劑時(shí),丹參水提取物中4個(gè)代表性色譜峰(峰1、2、3、7)的相對峰面積(以水提物中4個(gè)代表色譜峰的相對峰面積作為1)整體較高,且色譜峰較多、各峰分離度好、基線平穩(wěn),因此選擇20%甲醇作為丹參中丹酚酸類成分的提取溶劑。

        在優(yōu)化的超高壓提取條件下,進(jìn)一步對超高壓提取法、超聲波輔助提取法和水浴回流提取法進(jìn)行了比較,如圖2所示。結(jié)果表明,采用超高壓提取法,丹參中丹酚酸類成分提取率明顯優(yōu)于超聲波輔助提取法和水浴回流提取法。

        3.2 色譜條件優(yōu)化

        不同的親水柱材料對親水性化合物分離效果存在明顯差別。本研究對1.1節(jié)中所列的3 根不同類型的色譜柱(XBridge Amide色譜柱(4.6 mm×250 mm,3.5 μm,美國Waters)、Merck SeQuant ZIC-HILIC色譜柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm,德國Merck)、XBridge HILIC色譜柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm,美國Waters)進(jìn)行了比較,結(jié)果表明,使用Waters XBridge Amide色譜柱獲得的丹參甲醇水提取物各色譜峰分離度高、分布均勻、峰對稱性較好。因此,選擇Waters XBridge Amide柱用于丹參甲醇水提取物的分析。

        水和乙腈常被選作親水色譜的流動(dòng)相,丹參中丹酚酸類成分復(fù)雜、數(shù)量較多,本研究采用乙腈-水作為流動(dòng)相、采用梯度洗脫法用于其分離研究。由于酚酸類成分含有羧基,容易與色譜柱填料發(fā)生作用造成拖尾現(xiàn)象,加入一定量的有機(jī)弱酸會(huì)明顯抑制羧酸的電離,避免拖尾現(xiàn)象的發(fā)生。另外,流動(dòng)相中加入一定量的揮發(fā)性鹽,有助于改善色譜峰峰型,同時(shí)避免或減少對質(zhì)譜離子化的影響。考察了水相和有機(jī)相中分別加入不同含量甲酸揮發(fā)性鹽的影響,結(jié)果表明,當(dāng)選擇H2O(0.8%甲酸、20 mmol/L甲酸銨)+乙腈(0.8%甲酸)作流動(dòng)相時(shí),各色譜峰分離良好,峰型尖銳。

        由于乙腈-水體系對親水色譜柱上各丹酚酸類化合物洗脫能力較強(qiáng),造成分離效果差。考察了水相中添加不同比例乙腈、正丁醇的分離效果,結(jié)果表明,采用0.8%甲酸+20 mmol/L甲酸銨+30%乙腈+10%正丁醇作為流動(dòng)相A時(shí),丹參水提物中各化合物具有較好的保留和分離效果。

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