袁成良，鄒 寧，劉朝紅，鄒顏矯

(德陽市人民醫(yī)院檢驗科，四川德陽 618000)

肝細胞癌(HCC)占原發(fā)性肝癌的70%～85%，是全球癌癥最常見的死亡原因之一[1]。治療HCC包括手術(shù)切除和肝移植，但這僅僅對一小部分早期診斷的HCC患者有效[2]。造成這種結(jié)局的主要原因是HCC的高侵襲性和肝內(nèi)和(或)肝外轉(zhuǎn)移[3-4]。目前對HCC轉(zhuǎn)移和侵襲的機制研究多集中在已知基因上，但有不少學(xué)者通過對微小RNA(miRNA)的研究來了解HCC的生物學(xué)機制，并且收益頗多。本實驗通過miR-340轉(zhuǎn)染，利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、Transwell侵襲實驗和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)等技術(shù)來檢測上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)及核轉(zhuǎn)錄因子-κB1(NF-κB1)的表達，進一步探討miR-340對HCC細胞轉(zhuǎn)移、侵襲的影響及通過何種途徑來調(diào)控其轉(zhuǎn)移和侵襲，為預(yù)防、診斷和治療HCC提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人HCC細胞株HepG2、MHCC-97L和永生化的健康人輸卵管上皮細胞株FTE187從美國菌種保藏中心購得。

1.2儀器與試劑 ABI7500實時PCR儀購自美國賽默飛公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均從美國Gibco公司購得；LipofectamineTM2000 試劑購自美國Invitrogen；qPCR試劑盒購自荷蘭Qiagen公司；含細胞外基質(zhì)蛋白的基質(zhì)膠從美國BD生物購得；包被的Transwell培養(yǎng)皿(8 mm孔徑)購自美國Corning公司；ELISA試劑盒從武漢優(yōu)爾生生命科學(xué)裝備有限公司購得；Western blot所用裂解緩沖液、基于二喹啉甲酸比色法(BCA)的蛋白檢測試劑盒、化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑均購自中國生物技術(shù)研究所碧云天；蛋白酶抑制劑從德國默克購得；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)從美國Millipore購得；NF-κB1抗體、羊抗兔IgG二抗和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)購自美國細胞信號傳導(dǎo)技術(shù)公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 人 HCC細胞株HepG2、MHCC-97L和永生化的健康人輸卵管上皮細胞株FTE187均用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，嚴格按照說明書進行。

1.3.2miRNA瞬時轉(zhuǎn)染 HepG2 和MHCC-97L細胞株均轉(zhuǎn)染miR-340作為miR-340組。兩個細胞株不轉(zhuǎn)染miR-340為對照即miR-NC組。24 h后用LipofectamineTM2000 試劑將50 nmol/L的miR-340轉(zhuǎn)染入細胞。

1.3.3Transwell侵襲實驗 用含細胞外基質(zhì)蛋白的基質(zhì)膠包被的Transwell培養(yǎng)皿(8 mm孔徑)來評估細胞的侵襲力。細胞在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h,2×105個細胞懸浮于100 μL無血清DMEM，然后接種在頂室中，在下室中加入600 μL含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM。于37 ℃，5%CO2環(huán)境中孵育24 h后，用棉簽擦掉留在膜表面上的細胞，然后穿透細胞在甲醇中固定，再用0.1%結(jié)晶紫染色。用相差顯微鏡觀察并記錄侵襲到下層培養(yǎng)池中的細胞數(shù)目。

1.3.4qPCR檢測指標的表達情況 采用qPCR檢測miR-340和5種mRNA包括E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、MMP-2和MMP-9，用Trizol試劑提取細胞總RNA。2 μg RNA用于qPCR，用qPCR試劑盒進行RNA轉(zhuǎn)錄和擴增。SYBR GreenⅡ用來作為熒光信號，ROX作為對照熒光。mRNA的逆轉(zhuǎn)錄在Applied Biosystems GeneAmp PCR系統(tǒng)9700上進行，實時PCR在ABI7500實時PCR儀上進行。所有的樣本都同批檢測，以避免批間差。各樣品均做3份平行試驗取其均值。其表達水平由雙ΔCT(ΔΔCT)法進行分析，將GAPDH mRNA的表達作為標準品，用公式2-ΔΔCT來計算。另外采用ELISA試劑盒對上述培養(yǎng)上清液中MMP-2和MMP-9蛋白水平進行測定。

1.3.5Western blot分析 HepG2和MHCC-97L細胞在低溫PBS中洗滌2次，然后在RIPA裂解緩沖液與蛋白酶抑制劑中溶解。細胞裂解物的蛋白質(zhì)濃度用BCA試劑盒測定，50 μg蛋白通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。該膜用吐溫-20Tris緩沖鹽水(TBST)稀釋的5%牛奶室溫包被1 h，4 ℃用NF-κB1抗體(1∶1 000)孵育過夜。膜再用辣根過氧化物酶的羊抗兔IgG二抗孵育(1∶1 000)2 h。將蛋白用ECL試劑顯影。密度用的Image J軟件進行測定，每個樣本的值標準化為GAPDH(1∶1 000)的吸光度值。

1.3.6熒光素酶報告分析 HepG2和MHCC-97L細胞(2×105/孔)于轉(zhuǎn)染前接種于24孔板并培養(yǎng)過夜。細胞用pMIR-EGFR-3′UTR的野生型或突變型質(zhì)粒、miR-340或miR-NC和pRL-SV40質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，使用LipofectamineTM2000試劑。在共轉(zhuǎn)染48 h后，螢火蟲熒光素和海腎螢光素酶活性用雙熒光素酶報告系統(tǒng)定量檢測。各組均做3個平行實驗。

2 結(jié) 果

2.1HepG2和MHCC-97L細胞系中miR-340表達水平比較 qPCR系統(tǒng)檢測結(jié)果表明，與健康人輸卵管上皮細胞株FTE187(1.04±0.08)相比較，在HepG2(0.44±0.05)和MHCC-97L(0.46±0.07)細胞中miR-340表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2miR-340高表達抑制HepG2和MHCC-97L細胞的侵襲能力 侵襲能力通過Transwell侵襲實驗進行評價，HepG2和MHCC-97L細胞用miR-340和miR-NC轉(zhuǎn)染，然后在頂室接種。24 h后通過膜侵入的HepG2和MHCC-97L細胞被染色和定量。轉(zhuǎn)染了miR-340的HepG2細胞，通過Transwell小膜浸潤的數(shù)目(65±8個細胞/高倍視野)比miR-NC組(120±10個細胞/高倍視野)下降54.17%，在MHCC-97L細胞組(41±6個細胞/高倍視野)下降34.17%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 高表達的miR-340抑制HepG2和MHCC-97L細胞的侵襲

2.3miR-340高表達對HCC上皮細胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)分子的影響 采用qPCR檢測高表達miR-340的HepG2和MHCC-97L細胞中EMT標志物的表達水平。發(fā)現(xiàn)高表達miR-340的HepG2細胞和MHCC-97L細胞中E-鈣黏蛋白mRNA表達上調(diào)，分別為(2.72±0.04)和(2.16±0.03)；N-鈣黏蛋白mRNA分別為(0.21±0.01)、(0.34±0.02)表達下調(diào)；波形蛋白mRNA分別為(0.31±0.02)、(0.33±0.03)表達下調(diào)。而對照組HepG2和MHCC-97L細胞上對應(yīng)EMT標志物的表達水平分別為E-鈣黏蛋白mRNA(1.32±0.02)和(1.12±0.02)；N-鈣黏蛋白mRNA分別為(0.61±0.01)、(0.74±0.02)；波形蛋白mRNA分別為(0.52±0.02)、(0.61±0.03)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4HepG2和MHCC-97L細胞中miR-340高表達對MMP-2和MMP-9表達的影響 采用qPCR和ELISA分別檢測轉(zhuǎn)染miR-340的HepG2和MHCC-97L細胞中的MMP-2、MMP-9的mRNA和蛋白水平，結(jié)果顯示高表達miR-340的HepG2細胞MMP-2的mRNA(0.47±0.04)和蛋白(2.02±0.11)水平降低；MMP-9的mRNA(0.33±0.03)和蛋白(0.87±0.06)水平明顯降低，對照組HepG2細胞MMP-2的mRNA(0.67±0.05)和蛋白(3.24±0.18)，MMP-9的mRNA(0.57±0.04)和蛋白(1.56±0.08)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。高表達miR-340的MHCC-97L細胞MMP-2的mRNA(0.19±0.01)和蛋白(1.04±0.08)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；MMP-9的mRNA(0.27±0.02)和蛋白(1.63±0.07)水平也明顯降低，對照組MHCC-97L細胞MMP-2的mRNA(0.37±0.02)和蛋白(2.12±0.10)；MMP-9的mRNA(0.43±0.03)和蛋白(2.32±0.14)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

注：A表示HepG2細胞中的NF-κB1蛋白質(zhì)和GAPDH的表達；B表示MHCC-97L細胞中NF-κB1蛋白質(zhì)和GAPDH的表達

圖2miR-340轉(zhuǎn)染的HepG2和MHCC-97L細胞NF-κB1蛋白的表達

2.5TargetScan 6.2軟件預(yù)測miR-340的作用靶點 TargetScan 6.2軟件預(yù)測NF-κB1是miR-340的結(jié)合物，用Western blot對miR-340轉(zhuǎn)染的HepG2和MHCC-97L細胞中的NF-κB1蛋白質(zhì)表達進行測定，見圖2。結(jié)果顯示，上調(diào)miR-340后，HepG2細胞NF-κB1表達量(1.61±0.13)較miR-NC組(0.96±0.10)降低40%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，MHCC-97L細胞NF-κB1表達量(2.71±0.16)較miR-NC組(0.92±0.11)下降66%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。為了進一步證實NF-κB1是否是miR-340的直接靶點，將NF-κB1的3′-UTR野生型和突變型克隆到熒光素酶指示基因載體，結(jié)果顯示miR-340顯著抑制pMir NF-κB1 3′-UTR WT的熒光素酶活性。

3 討 論

miRNA是長度為21～23個核苷酸的序列[5]，是調(diào)節(jié)基因表達的新指標，能夠調(diào)節(jié)細胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。近年來，miR-340被認為是腫瘤抑制基因，在多種生物學(xué)過程如細胞遷移和侵襲中發(fā)揮作用[7-13]。研究發(fā)現(xiàn)其在胃癌、食管癌和乳腺癌中表達降低[14-17]，miR-340在食管癌細胞表達降低，作為抑癌基因通過下調(diào)磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶1(PSAT1)抑制食管癌細胞的生長、集落形成和侵襲[10]。高表達的miR-340作用于高遷移率族核小體結(jié)合域5(HMGN5)抑制前列腺癌細胞的增殖和侵襲[13]。本研究重點研究了miR-340在人類HCC發(fā)病機制中的作用。

本研究通過qPCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-340水平在HCC細胞株HepG2和MHCC-97L比健康人輸卵管上皮細胞系FTE187顯著降低，換言之，增加miR-340水平可抑制HCC細胞生長發(fā)育。這與之前學(xué)者報道的miR-340能降低腫瘤的發(fā)生率相符[18]。此外，一些報道還證實了miR-340在大腸癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤和口腔鱗狀細胞癌也明顯下調(diào)[9]。這表明miR-340異?？梢娪诙喾N類型的癌癥細胞和組織，因此，推測miR-340降低在腫瘤發(fā)生中起著關(guān)鍵作用。

通過Transwell試驗發(fā)現(xiàn)，miR-340可顯著抑制HCC細胞的侵襲。那么，miR-340是如何影響腫瘤細胞侵襲的呢？通過檢測miR-340轉(zhuǎn)染的HepG2和MHCC-97L細胞中EMT標志物，EMT是上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的過程，是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程，研究發(fā)現(xiàn)，EMT在HCC的遷移侵襲過程中起到關(guān)鍵性的作用[19]，結(jié)果表明，miR-340可通過大幅上調(diào)上皮標志物E-鈣黏蛋白和下調(diào)間充質(zhì)標記物N-鈣黏蛋白和波形蛋白從而顯著抑制腫瘤細胞的侵襲能力，這個結(jié)果表明miR-340可通過抑制EMT來抑制細胞的侵襲能力。

MMP是一類降解細胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，在多種腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。KAMEL等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2的過表達與卵巢上皮癌的浸潤和轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。LIU等[22]發(fā)現(xiàn)MMP-9的高表達與鼻咽癌淋巴轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)，在本研究中，用qRT-PCR和ELISA分別檢測轉(zhuǎn)染miR-340細胞的MMP-2與MMP-9的mRNA與蛋白水平。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-340細胞的MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白水平明顯減少，表明上調(diào)的miR-340可通過下調(diào)MMP-2和MMP-9來抑制細胞的遷移能力。那么推測在miR-340表達降低的HCC細胞中，MMP-2和MMP-9增加了細胞的轉(zhuǎn)移能力。

已有報道稱miR-340可通過靶向CDK6，RHCCK1和cMet來影響癌細胞的生長、轉(zhuǎn)移[8-13]。雖然生物信息學(xué)工具可能有助于揭示miRNA作用的靶mRNA，但這需要用其他試驗來驗證。在本文中，顯示miR-340的作用靶點是NF-κB1 mRNA，從而揭示了有關(guān)腫瘤發(fā)生的可能機制。實際上，NF-κB1是Rel/NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，在免疫反應(yīng)、胚胎和細胞譜系發(fā)育和腫瘤發(fā)生等都起著關(guān)鍵作用[23]。本研究結(jié)果表明，NF-κB1是miR-340的作用靶點。首先，使用免疫印跡確認了miR-340會導(dǎo)致NF-κB1蛋白水平的顯著下降。然后發(fā)現(xiàn)miR-340的結(jié)合區(qū)與NF-κB1的mRNA的3′UTR互補。而且，NF-κB13′-UTR螢光素酶活性對miR-340的上調(diào)有極強敏感性，miR-340結(jié)合位點突變?nèi)コ薽iR-340對螢光素酶活性的調(diào)節(jié)作用。因此，斷定miR-340直接調(diào)節(jié)NF-κB1表達。

研究者發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9與NF-κB1發(fā)生了同方向改變，但E-鈣黏蛋白與NF-κB1卻發(fā)生了反方向改變。有報道證實了miR-9通過直接靶向NF-κB1表達和下調(diào)其下游分子MMP-2和MMP-9來抑制葡萄膜黑色素瘤細胞的遷移和侵襲[24-26]。另有報道表明miR-9可以通過目標基因NF-κB1抑制E-鈣黏蛋白表達來從而抑制黑色素瘤細胞的轉(zhuǎn)移[27]。因此，推測miR-340通過NF-κB1調(diào)節(jié)MMP-2，MMP-9和E-鈣黏蛋白從而抑制肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

4 結(jié) 論

miR-340在HCC細胞株中表達降低，其作用的靶基因為NF-κB1，上調(diào)其表達可以增加E-鈣黏蛋白和降低N-鈣黏蛋白和波形蛋白從而顯著抑制EMT，另外，還可以降低MMP-2和MMP-9從而抑制肝癌細胞轉(zhuǎn)移和侵襲。這種新的miR-340/NF-κB1途徑可能對肝癌的潛在分子機制和轉(zhuǎn)移提供新的見解，高表達的miR-340可能為未來預(yù)防、診斷和治療HCC提供新的思路和有效方案，具有潛在臨床應(yīng)用價值。