袁 莉,王 威,王 剛,王曉琴

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:1493722680@qq.com)

活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time,APTT)是臨床上篩選內(nèi)源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ及FⅫ缺乏的首選實(shí)驗(yàn),同時(shí)還可用做普通肝素的治療監(jiān)測(cè)及狼瘡抗凝物的篩選。對(duì)常規(guī)術(shù)前凝血結(jié)果的解釋;有出血癥狀的單因子缺乏患者的檢測(cè);以及手術(shù)和創(chuàng)傷后的異常出血等均需要了解和評(píng)估所使用APTT試劑對(duì)內(nèi)源性凝血因子缺乏的敏感性[1,2]。美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)在2008年就發(fā)布了一期法PT和APTT實(shí)驗(yàn)指南(H47-A2)[3],給出了評(píng)估APTT試劑因子敏感性的方法。盡管該指南操作簡(jiǎn)單易行,但有文獻(xiàn)報(bào)道不同來源的乏因子血漿或者不同廠家的乏因子血漿獲得的敏感性結(jié)果存在差異[4,5],目前國(guó)內(nèi)尚未見類似報(bào)道。因此本研究采用商品化血漿和單因子缺乏患者血漿,分別評(píng)估實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用APTT試劑的內(nèi)源性凝血因子缺乏的敏感性,并比較其差異。期望為檢驗(yàn)結(jié)果的合理解釋及臨床干預(yù)提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器:日本Sysmex CA7000全自動(dòng)血凝儀;試劑:APTT測(cè)定試劑盒(上海太陽生物技術(shù)有限公司),接觸激活劑為鞣花酸;磷脂種類為兔腦磷脂,CaCl2濃度為0.025 mmol/L。

1.2 樣本來源

商品化標(biāo)準(zhǔn)血漿、乏Ⅷ因子血漿、乏Ⅸ因子血漿、乏Ⅺ因子血漿、乏Ⅻ血漿均為凍干品,均來自于SIEMENS公司。單因子缺乏的患者血漿來自于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院2016-01～2018-12的臨床檢測(cè)樣本共213例,另有10例來自健康人的血漿,單因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ缺乏病例分別有109例、58例、14例和22例,樣本無溶血、脂血及黃疸。采用0.109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝管,離心分離獲得乏血小板血漿。所有樣本進(jìn)行四個(gè)內(nèi)源性因子檢測(cè)。

1.3 研究方法

凍干標(biāo)準(zhǔn)血漿以及乏因子血漿用無菌注射用水復(fù)溶。經(jīng)CA7000儀器檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)血漿及缺乏單因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ血漿的因子活性。APTT因子敏感性評(píng)估依據(jù)CLSI H47-A2指南進(jìn)行:采用商品化的單因子缺乏血漿與標(biāo)準(zhǔn)血漿按比例配制出不同單因子活性的混合血漿,因子活性范圍在<1%到100%之間,上機(jī)進(jìn)行APTT檢測(cè)。同時(shí)檢測(cè)FⅧ、FⅨ、FⅪ及FⅫ活性和APTT值。正常參考區(qū)間來自于本實(shí)驗(yàn)室:28-43.5 s(120例健康捐獻(xiàn)者新鮮血漿建立)。所有標(biāo)本均在4 h內(nèi)完成測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

來自商品化的標(biāo)準(zhǔn)血漿和乏因子商品血漿配置的不同因子濃度水平的混合血漿進(jìn)行APTT測(cè)定,所得的APTT值分別與相應(yīng)的凝血單因子活性擬合非線性回歸曲線,曲線與正常參考區(qū)間上限交叉點(diǎn)的百分活度(%)即相應(yīng)因子的敏感性。來自單因子缺乏的患者血漿直接記錄其所測(cè)因子活性和相應(yīng)APTT值,因子敏感性獲得方法同前。采用extra-sum-of-F檢驗(yàn)比較兩種方法的最佳擬合非線性回歸方程,分析各數(shù)據(jù)集得到的方程是否不同。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 5(GraphPad Software,Inc.La Jolla,CA,USA)軟件。

2 結(jié)果

2.1 商品化標(biāo)準(zhǔn)血漿與乏因子商品血漿內(nèi)源性凝血因子活性測(cè)定結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)血漿與4個(gè)乏因子血漿FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ的因子活性(見表1)。標(biāo)準(zhǔn)血漿的因子活性均在正常參考區(qū)間內(nèi)。乏因子血漿除特定因子活性<1%外,其余因子活性均在正常參考區(qū)間內(nèi)(70%-120%)。

表1 商品化標(biāo)準(zhǔn)血漿及乏因子商品血漿FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ的活性(%)

Table 1 Activity of commercialization of standard plasma and FⅧ, FⅨ, FⅨ and FⅫ deficiency plasma(%)

試劑FⅧFⅨFⅪFⅫ標(biāo)準(zhǔn)血漿 101.810991.5101.8乏FⅧ血漿<182.171.284.3乏FⅨ血漿87.4<176.379.1乏FⅪ血漿84.778.2<171.9乏FⅫ血漿92.685.483.4<1

2.2 單因子缺乏患者血漿的內(nèi)源性凝血因子活性的分布

來自單因子缺乏患者血漿的內(nèi)源性凝血因子活性分布(見表2)。單因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ缺乏病例分別有109例、58例、14例和22例,重度(<1%)缺乏病例整體比例小,中度(1%-5%)缺乏病例次之,輕型(>5%-40%)因子缺乏比例最高。

表2 來自單因子缺乏患者血漿的內(nèi)源性凝血因子活性的分布(例)

Table 2 Distribution of endogenous coagulation factor activity in plasma from patients with single factor deficiency(cases)

分組n內(nèi)源性凝血因子活性<1%1%-5%>5%-40%FⅧ缺乏患者10923770FⅨ缺乏患者5821343FⅪ缺乏患者14248FⅫ缺乏患者220517

2.3 商品化乏因子血漿和單因子缺乏患者血漿評(píng)估內(nèi)源性凝血因子敏感性結(jié)果的比較

兩種不同來源血漿評(píng)估4個(gè)內(nèi)源性凝血因子敏感性的非線性回歸曲線(見圖1)。圖中虛線結(jié)果為來自單因子缺乏的病人血漿,實(shí)線結(jié)果來自商品化乏因子血漿,并顯示了兩種方法評(píng)估結(jié)果的非線性回歸系數(shù)R2。來自于病人血漿FⅧ活性在<1%-118%之間,FⅨ活性在<1%-115%之間,FⅪ活性在<1%-95%之間,FⅫ活性在<1%-80%之間。

兩種不同來源血漿對(duì)內(nèi)源性因子的評(píng)估結(jié)果,結(jié)果顯示來自單因子缺乏病人血漿的評(píng)估結(jié)果均明顯低于商品化血漿,其中FⅧ、FⅪ和FⅫ的兩種方法評(píng)估結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表3)。

APTT:活化部分凝血活酶時(shí)間(s);CLSI:商品化乏因子血漿評(píng)估因子敏感性的方法;patients:患者單因子缺乏血漿評(píng)估因子敏感性的方法圖1 不同來源血漿進(jìn)行內(nèi)源性凝血因子敏感性評(píng)估的非線性回歸曲線Figure 1 Nonlinear regression curves for sensitivity assessment of endogenous coagulation factors in plasma from different sources

表3 商品化乏因子血漿和單因子缺乏患者血漿評(píng)估內(nèi)源性凝血因子敏感性結(jié)果比較(%)

Table 3 Comparison of plasma sensitivity of endogenous coagulation factors from commercial and patients plasma with single factor deficiency(%)

血漿來源 FⅧ敏感性FⅨ敏感性FⅪ敏感性FⅫ敏感性商品化乏因子血漿68.2 63.8 66.8 54.8 單因子缺乏病人血漿58.653.034.632.8 F10.980.85399.35810.05 P0.00010.46990.00120.0007

因子敏感性的結(jié)果是以超出APTT正常參考區(qū)間上限時(shí)的百分活度(%)表示

3 討論

APTT是臨床上篩選內(nèi)源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ及FⅫ缺乏的首選實(shí)驗(yàn)。有出血癥狀的單因子缺乏患者及手術(shù)和創(chuàng)傷后的異常出血等均需要了解凝血因子的缺乏程度。輕型血友病A和B是指相應(yīng)凝血因子FⅧ和FⅨ活性或濃度在5%-40%(IU/dl)之間,在大型手術(shù)或創(chuàng)傷后可導(dǎo)致嚴(yán)重出血[6]。對(duì)于FⅪ缺乏患者,其臨床出血表現(xiàn)不一,甚至某些病人FⅪ在40%的活性時(shí)表現(xiàn)為嚴(yán)重的出血和凝血酶生成減少[7]。FⅫ活性的減低不會(huì)引起明顯的出血現(xiàn)象,研究報(bào)道:遺傳性FⅫ缺陷的病人,FⅫ活性為2%,FⅫ抗原<1%時(shí)也未見明顯出血[8,9]。因而,凝血因子的準(zhǔn)確檢測(cè)是臨床診斷及治療的重要依據(jù)。美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)指南指出對(duì)于FⅧ、FⅨ和FⅪ的敏感性應(yīng)該在30%-45%之間,過高(大于50%)可導(dǎo)致健康人群的APTT結(jié)果出現(xiàn)延長(zhǎng);過低(小于30%)則難以篩查出凝血因子輕度缺乏的的患者[3,10]。而APTT是使用最為廣泛的凝血因子缺乏的篩查實(shí)驗(yàn),且不同試劑對(duì)因子敏感性差異較大[11],因此掌握APTT試劑對(duì)內(nèi)源性凝血因子缺乏的敏感性非常重要,不但能夠幫助實(shí)驗(yàn)室根據(jù)需要選擇恰當(dāng)?shù)脑噭12],而且對(duì)于輕度凝血因子缺乏患者的結(jié)果解釋和臨床干預(yù)能夠提供重要的指導(dǎo)作用。

CLSI H47-A2指南推薦使用商品化的標(biāo)準(zhǔn)血漿和商品乏因子血漿評(píng)估APTT試劑的敏感性[3],但有研究表明:不同來源商品化乏因子血漿的評(píng)估結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,甚至某些因子評(píng)估結(jié)果間差異高達(dá)四倍之多[5]。這一結(jié)果表明商品化血漿的基質(zhì)效應(yīng)并非是導(dǎo)致差異的主要原因,因?yàn)椴煌σ蜃友獫{的凝血酶生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦存在差異,且乏因子血漿的凝血酶生成潛力越大其評(píng)估因子的敏感性越高[5]。一項(xiàng)分別使用了商品化和病人來源的乏因子血漿進(jìn)行敏感性評(píng)估的研究,其結(jié)果顯示病人來源的單因子缺乏血漿的評(píng)估結(jié)果更高[4]。因此本研究同時(shí)采用兩種來源的乏因子血漿進(jìn)行敏感性評(píng)估,發(fā)現(xiàn)我室使用的APTT試劑-儀器組合對(duì)四個(gè)內(nèi)源性凝血因子缺乏的敏感性均較高,達(dá)到了30%以上,甚至FⅧ和FⅨ敏感性在50%以上。當(dāng)后者活性輕度減低至50%-60%之間時(shí)即可表現(xiàn)出APTT延長(zhǎng)。但我們的結(jié)果顯示商品化乏因子血漿的評(píng)估結(jié)果高于患者血漿,且兩種方法評(píng)估FⅧ、FⅪ和FⅫ敏感性差異有統(tǒng)計(jì)意義,而Martinuzzo等[4]的結(jié)果表明患者血漿的評(píng)估結(jié)果更高,比較后發(fā)現(xiàn)兩項(xiàng)研究使用了不同廠家的乏因子血漿。這也再次說明使用商品化血漿進(jìn)行因子敏感性評(píng)估并不可靠。本研究與其同樣使用單因子缺乏患者血漿對(duì)4個(gè)因子評(píng)估敏感性的趨勢(shì)相似,尤其FⅧ和FⅪ評(píng)估結(jié)果相近,因?yàn)閮烧卟捎昧讼嗤募せ顒坊ㄋ?而激活劑的種類正是不同APTT試劑引起因子敏感性差異的重要因素[13,14]?？傊?我們的研究結(jié)果表明采用CLSI指南的商品化血漿對(duì)因子敏感評(píng)估的結(jié)果不可靠。本研究采用來自病人的乏因子血漿進(jìn)行因子敏感性評(píng)估,且乏FⅧ和FⅨ的樣本量是既往國(guó)外相似研究[4]的近3倍,能夠更好地反映我們使用的儀器-試劑組合對(duì)因子敏感性檢測(cè)的真實(shí)情況。

本研究存在的不足：一是來自于單因子缺乏患者血漿的評(píng)估經(jīng)歷了近兩年時(shí)間,其中包含試劑批號(hào)的改變,實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的一些誤差。依據(jù)CNAS-CL02-A001臨床血液學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域應(yīng)用說明,APTT試劑更換批號(hào)時(shí)均需要做試劑更換驗(yàn)證,采用5份正常樣本新舊批號(hào)同時(shí)檢測(cè),5份樣本中需滿足80%及以上的相對(duì)偏差小于1/2行標(biāo),認(rèn)為批間差異可接受,無需更換參考區(qū)間。目前還未發(fā)現(xiàn)不同批號(hào)間結(jié)果存在較大差異。二是FⅧ和FⅪ病例中盡管中輕度缺乏病人比例較高,但是在因子活性為40%左右的樣本僅占據(jù)少數(shù),而對(duì)于FⅪ和FⅫ,這兩者缺乏的病例較為少見甚至罕見,因此這些均可能造成敏感性評(píng)估的不準(zhǔn)確。

綜上,商品化血漿和單因子缺乏患者血漿在評(píng)估APTT試劑內(nèi)源性凝血因子敏感性時(shí)存在顯著性差異?；贑LSI指南的商品化血漿評(píng)估方法易于標(biāo)準(zhǔn)化且簡(jiǎn)單易行,缺點(diǎn)是不同商品化試劑評(píng)估結(jié)果差異較大,結(jié)果并不可信。而應(yīng)用單因子缺乏患者新鮮血漿的評(píng)估程序不易短期內(nèi)收集足量病例,且某一因子活性過高時(shí)也可能導(dǎo)致對(duì)其他因子缺乏的抵消,評(píng)估過程中多個(gè)試劑批號(hào)的使用、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部誤差的存在以及輕度單因子缺乏病例相對(duì)較少等因素也易造成評(píng)估結(jié)果的偏倚。因而需要更進(jìn)一步的分析和研究,為臨床提供更可靠的指導(dǎo)作用。