李儒佑,馮六連,柯正華,周 朕,黃永軍,王鋼勝

(鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院,湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,黃石 435000;*通訊作者,E-mail:995491185@qq.com)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是常見和多發(fā)的一種非特異性炎癥性疾病,近年來發(fā)病率呈上升趨勢[1],在給患者生活質(zhì)量帶來影響的同時,亦可導(dǎo)致哮喘、鼻竇炎等的發(fā)生和進展,從而進一步加劇了患者痛苦[2]。研究表明[3],免疫炎癥反應(yīng)在AR發(fā)病及進展中發(fā)揮重要作用。NOD樣受體蛋白結(jié)構(gòu)域3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體是由NLRP3、接頭蛋白凋亡相關(guān)點樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein,ASC)和半胱天冬酶1(Caspase-1)組成的、存在于細胞內(nèi)的一種復(fù)合體,在促進炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[4],有研究指出[5],NLRP3炎癥小體活化參與了AR發(fā)病,且與炎癥反應(yīng)程度有關(guān)?；蛑亟M干擾素作為由人體細胞分泌的蛋白,其中,γ干擾素(IFN-γ)是主要類型之一,在免疫調(diào)節(jié)及抗炎中發(fā)揮重要作用[6]。IFN-γ是否通過影響NLRP3炎癥小體活化而參與AR發(fā)病,目前鮮有報道。本研究通過構(gòu)建大鼠AR模型,并采用鼻腔滴入的方式給予IFN-γ干預(yù),觀察其對大鼠鼻黏膜中NLRP3炎癥小體活化的影響,以期為AR臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

重組大鼠IFN-γ購自德國RELIATech公司,卵清蛋白(ovalbumin,OVA)和氫氧化鋁粉劑購自美國Sigma公司,Trizol總RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增試劑購自日本TaKaRa公司,NLRP3、ASC、Caspase-1和內(nèi)參序列由上海生工生物公司設(shè)計合成,兔抗大鼠NLRP3多克隆抗體購自美國Abcom公司,兔抗大鼠ASC、pro-Caspase-1和Caspase-1 P20多克隆抗體購自美國SantaCruz公司,鼠白細胞介素-1β(IL-1β)和IL-8檢測試劑盒購自上海恒遠生化試劑有限公司,鼠OVA特異性IgE(OVA specific IgE,OVA-sIgE)檢測試劑盒購自上海信帆生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

雄性SD大鼠30只,SPF級,體質(zhì)量240-280 g,8周齡,購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司(合格證號:SCXK(滬)2017-0005),飼養(yǎng)于標準環(huán)境,自由飲水進食,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。利用隨機數(shù)字表隨機分為對照組、AR組和IFN-γ組,每組10只。

1.3 AR大鼠模型構(gòu)建

參考文獻[7]中的方法構(gòu)建AR大鼠模型?；A(chǔ)致敏:制備含0.3 mg OVA和30 mg氫氧化鋁粉劑的生理鹽水1 ml,對AR組和IFN-γ組大鼠進行腹腔注射,隔日1次,注射7次,對照組大鼠則腹腔注射含30 mg氫氧化鋁粉劑的生理鹽水,用法用量同AR組和IFN-γ組。強化致敏:從第14天開始,AR組和IFN-γ組大鼠分別用含5% OVA的生理鹽水滴鼻,雙側(cè)鼻腔各滴100 μl,1次/d,連續(xù)7 d。激發(fā)AR:強化致敏后,間隔7 d,用50 μl的1% OVA進行激發(fā),連續(xù)20 d,均出現(xiàn)AR典型的癥狀和體征,如嗜睡、毛蓬松、活動減少、噴嚏不止并搔抓鼻部、出現(xiàn)鼻流液、覓食改變等,且隨著激發(fā)次數(shù)增多而癥狀加重。對照組大鼠則以同樣的方法給予等量的生理鹽水。整個建模過程中各組大鼠均無死亡。AR組和IFN-γ組大鼠從激發(fā)第1天開始,在給予OVA激發(fā)前30 min,分別給予PBS和IFN-γ(濃度為0.02 μg/μl)滴鼻,50 μl/側(cè),1次/d。

1.4 AR大鼠模型評價

各組大鼠于末次激發(fā)后30 min內(nèi),對大鼠進行行為學(xué)評分[8]。流涕:1分,涕流至鼻前孔；2分,超過鼻前孔；3分,涕流到面部;噴嚏:1分,1-3個；2分,4-10個；3分,>10個;搔鼻:1分,輕輕擦鼻2次以內(nèi)；2分,反復(fù)劇烈擦鼻不止。各項得分相加,>5分則提示模型構(gòu)建成功。

1.5 標本采集

各組大鼠于評價結(jié)束后,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,用無菌生理鹽水對各組大鼠雙側(cè)鼻腔灌洗,收集灌洗液,4 ℃,3 500 r/min離心15 min,取上清,-80 ℃保存;處死各組大鼠,取血液2 ml,3 500 r/min離心10 min,-80 ℃保存;分離大鼠鼻骨前皮膚,去除鼻骨,取雙側(cè)鼻腔呼吸區(qū)黏膜,立刻置于液氮中,-70 ℃保存。

1.6 實時熒光定量PCR

取雙側(cè)鼻腔呼吸區(qū)黏膜組織,剪碎研磨,加入細胞裂解液,離心取上清,加入總RNA提取試劑,離心取沉淀,用紫外分光光度計檢測RNA純度,以A260/A280>1.80為合格。用逆轉(zhuǎn)錄試劑對RNA進行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板用PCR儀對引物擴增。引物序列:NLRP3:上游5′-CTGCATGCCGTATCTGGTTG-3′,下游5′-GCTGAGCAAGCTAAAGGCTTC-3′;ASC:上游5′-AGACATGGGCATACAGGAGC-3′,下游5′-GCAATGAGTGCTTGCCTGTG-3′;Caspase-1:上游5′-AAGAAGGTGGCGCATTTCCT-3′,下游5′-GACGTGTACGAGTGGGTGTT-3′;GAPDH:上游5′-TGCACCACCAACTGCTTAG-3′,下游5′-GATGCAGGGATGATGTTC-3′。反應(yīng)條件:92 ℃ 3 min,92 ℃ 30 s,92 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,76 ℃ 30 s,共36個循環(huán),每個樣品設(shè)平行復(fù)孔6個,用2-ΔΔCt法計算大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA相對表達量。

1.7 Western blot檢測

取雙側(cè)鼻腔呼吸區(qū)黏膜組織,剪碎研磨,加入細胞裂解液,離心、提取總蛋白。BCA法檢測濃度,取50 μg總蛋白,聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜,5%脫脂奶粉封閉60 min,加入一抗兔抗大鼠NLRP3、ASC、pro-Caspase-1和Caspase-1 P20多克隆抗體(稀釋比例為1 ∶800，1 ∶1 000，1 ∶500和1 ∶600),4 ℃過夜孵育，TBST沖洗3次，加入二抗辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG，室溫孵育120 min，TBST沖洗3次，暗室曝光20 min，拍照，用Image J圖像分析軟件分析對各條帶灰度值分析。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA法)

利用ELISA法檢測大鼠雙側(cè)鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6和IL-8及血清中OVA-sIgE濃度,在標準條件下嚴格按照試劑盒說明完成操作。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 重組IFN-γ滴鼻對AR大鼠癥狀的影響

AR組和IFN-γ組大鼠在激發(fā)后均出現(xiàn)了AR癥狀,但IFN-γ組大鼠癥狀較AR組輕,對照組則僅有少數(shù)大鼠有抓撓鼻部的表現(xiàn),未出現(xiàn)其他癥狀;末次激發(fā)后30 min內(nèi),對照組、AR組和IFN-γ組行為學(xué)評分分別為(0.80±0.79)分、(7.80±1.48)分和(5.50±0.71)分,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=146.132,P<0.01),AR組大鼠行為學(xué)評分高于對照組,而IFN-γ組大鼠行為學(xué)評分低于AR組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 重組IFN-γ對鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA表達的影響

AR組大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA相對表達量均高于對照組,而IFN-γ組大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA相對表達量均低于AR組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

表1 大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA表達(n=10)

Table 1 Expression of NLRP3, ASC and Caspase-1 mRNA in nasal mucosa of rats(n=10)

分組NLRP3 mRNAASC mRNACaspase-1 mRNA對照組1.03±0.141.00±0.061.02±0.07AR組1.86±0.17a1.63±0.14a1.72±0.10aIFN-γ組1.53±0.16ab1.38±0.15ab1.40±0.06ab F69.69366.736216.044 P<0.01<0.01<0.01

與對照組比較,aP<0.05;與AR組比較,bP<0.05

2.3 重組IFN-γ對鼻黏膜中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1和Caspase-1 P20蛋白表達的影響

AR組大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 P20蛋白相對表達量均高于對照組,而pro-Caspase-1蛋白相對表達量低于對照組,IFN-γ組大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC、Caspase-1和Caspase-1 P20蛋白相對表達量均低于AR組,而pro-Caspase-1蛋白相對表達量高于AR組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

表2 大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達(n=10)

Table 2 Expression of NLRP3, ASC and Caspase-1 proteins in nasal mucosa of rats(n=10)

分組NLRP3ASCpro-Caspase-1Caspase-1 P20對照組0.25±0.030.19±0.020.68±0.090.18±0.07AR組0.75±0.06a0.79±0.05a0.28±0.050.67±0.07aIFN-γ組0.48±0.04ab0.41±0.05ab0.44±0.050.52±0.08ab F201.910235.18692.14966.428 P<0.01<0.01<0.01<0.01

與對照組比較,aP<0.05;與AR組比較,bP<0.05。

圖1 大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達Figure 1 Expression of NLRP3, ASC and Caspase-1 proteins in nasal mucosa of rats

2.4 重組IFN-γ對鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6和IL-8及血清中OVA-sIgE的影響

AR組大鼠雙側(cè)鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6和IL-8水平及血清中OVA-sIgE濃度均高于對照組,而IFN-γ組大鼠雙側(cè)鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6水平和IL-8及血清中OVA-sIgE濃度均低于AR組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表3)。

表3 各組大鼠雙側(cè)鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6和IL-8水平及血清中OVA-sIgE濃度(n=10,pg/ml)

Table 3 The levels of IL-1β, IL-6 and IL-8 in bilateral nasal lavage fluid and the concentration of OVA-sIgE in serum in each group(n=10,pg/ml)

分組IL-1βIL-6IL-8OVA-sIgE對照組33.17±5.6225.73±5.4433.34±6.49 21.52±5.04AR組85.52±6.73a67.89±6.81109.39±15.68a48.25±6.17aIFN-γ組57.16±7.72ab39.65±5.49 71.37±9.12ab35.64±4.28ab F151.094130.403116.900105.529 P<0.01<0.01<0.01<0.01

與對照組比較,aP<0.05;與AR組比較,bP<0.05

3 討論

AR是由過敏原引起的IgE介導(dǎo)的多種炎癥介質(zhì)、細胞因子及免疫活性細胞參與的鼻黏膜慢性炎癥,具有發(fā)病率高、對人群生活質(zhì)量影響大的特點[9]。該病病因及發(fā)病機制較為復(fù)雜,在治療時主要以抗組胺藥及皮質(zhì)類固醇等為一線治療藥,但這些藥物均會帶來不同程度的不良反應(yīng)[10]。IFN-γ作為近年來用于免疫調(diào)節(jié)的藥物,在改善免疫力及抑制炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[11],重組IFN-γ是通過基因工程合成,其生物學(xué)活性與人體產(chǎn)生的完全一致[12],同時,該藥無抗組胺藥及皮質(zhì)類固醇等的不良反應(yīng),已被用于肝纖維化[13]及自身免疫性疾病[14]的臨床治療。嚴孝花等[15]指出,重組人IFN-γ治療變應(yīng)性鼻炎可獲得明顯的近期療效。本研究利用OVA對大鼠全身致敏及局部激發(fā)的方法制備AR模型,結(jié)果顯示,AR組和IFN-γ組大鼠在激發(fā)后均出現(xiàn)了AR癥狀,如嗜睡、毛蓬松、活動減少、噴嚏不斷并搔抓鼻部、出現(xiàn)鼻流液、覓食改變等,且隨著激發(fā)次數(shù)增多而癥狀加重,且行為學(xué)評分均在5分以上,而對照組則僅有少數(shù)大鼠有抓撓鼻部的表現(xiàn),說明成功構(gòu)建了大鼠AR模型。同時,本研究結(jié)果顯示,IFN-γ組大鼠在激發(fā)后AR癥狀較AR組輕,且末次激發(fā)后30 min內(nèi)行為學(xué)評分低于AR組,說明IFN-γ滴鼻干預(yù)可有效減輕大鼠AR癥狀。

炎癥小體是存在于細胞中的多蛋白復(fù)合物,在介導(dǎo)機體免疫應(yīng)答、自發(fā)炎癥及自身免疫性疾病發(fā)生、進展中發(fā)揮重要作用[16],NLRP3炎癥小體是主要的炎癥小體類型,由NLRP3蛋白、ASC和Caspase-1組成,一般情況下,NLRP3蛋白處于抑制狀態(tài),一旦受到外界刺激(如病原微生物、胞內(nèi)代謝物等)時,NLRP3蛋白便會與配體結(jié)合發(fā)生結(jié)構(gòu)改變,進而與ASC結(jié)合,通過ASC的CARD結(jié)構(gòu)域招募并將Caspase-1激活,而Caspase-1活化則可對無活性的IL-1β、IL-18等前體進行加工活化,從而成為有活性的IL-1β和IL-8炎癥因子,并促進其分泌至胞外發(fā)揮炎癥級聯(lián)反應(yīng)[17],亦有研究指出[18],NLRP3炎癥小體激活可促使IL-6分泌增加而促進炎癥反應(yīng)。IFN-γ可以通過活化誘導(dǎo)型一氧化碳合酶而加速胞內(nèi)NO合成,而NO可通過誘導(dǎo)NLRP3亞硝基化而阻止炎癥小體的組裝[19]。本研究結(jié)果顯示,AR組大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA相對表達量均高于對照組,AR組大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 P20蛋白相對表達量均高于對照組,而pro-Caspase-1蛋白相對表達量低于對照組,AR組大鼠雙側(cè)鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6和IL-8及血清中OVA-sIgE濃度均高于對照組,說明NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了AR發(fā)病過程,同時,本研究結(jié)果顯示,IFN-γ組大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA相對表達量均低于AR組,IFN-γ組大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC、Caspase-1和Caspase-1 P20蛋白相對表達量均低于AR組,而pro-Caspase-1蛋白相對表達量高于AR組,IFN-γ組大鼠雙側(cè)鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6和IL-8及血清中OVA-sIgE濃度均低于AR組,說明IFN-γ可能通過抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)而減輕AR大鼠癥狀。

綜上所述,重組IFN-γ滴鼻對AR大鼠具有一定的治療效果,可有效減輕AR大鼠癥狀,其機制可能與重組IFN-γ抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān),有望為AR臨床應(yīng)用提供實驗支持。