雷曉鳴,孟麗華,蔣文軍,李 雪,張珍妮

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:Jennyzzn@sohu.com)

I/R損傷發(fā)生在許多臨床情況下,機(jī)制非常復(fù)雜,涉及氧化應(yīng)激、炎癥等許多因素,導(dǎo)致細(xì)胞的壞死或者凋亡[1]。氧化應(yīng)激是I/R損傷的始動(dòng)因素[2],有學(xué)者認(rèn)為抗氧化劑需要同時(shí)具備多個(gè)作用靶點(diǎn)和容易穿過(guò)血腦屏障的特點(diǎn),在I/R損傷的治療中才有更好的臨床前景[3]。槲皮素可以從蔬菜、水果中提取,抗氧化能力是其保護(hù)神經(jīng)功能的基礎(chǔ),近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其具有減輕局灶性腦I/R損傷的作用[4]。低血壓、休克、心跳驟停等導(dǎo)致的全腦I/R損傷是導(dǎo)致患者進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、殘疾甚至死亡的重要原因[5],槲皮素對(duì)全腦I/R損傷是否具有保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用全腦性I/R損傷模型,觀察槲皮素對(duì)全腦I/R損傷大鼠的作用,為槲皮素的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

健康成年雄性SPF級(jí)SD大鼠216只,8-10周齡,體質(zhì)量(300±20)g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(陜)2015-003)。槲皮素(美國(guó)Sigma公司,dH2O/0.1% Tween-80配成所需濃度),伊文氏藍(lán)(河北博海生物工程開(kāi)發(fā)有限公司),水合氯醛(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院),4%多聚甲醛(天津市博迪化學(xué)有限公司),DAB顯色試劑盒(北京中山金橋公司),DCFH-DA(美國(guó)Sigma公司),引物合成(大連寶生物公司),TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司),PrimeScript RT-PCR Kit(大連寶生物公司),Premix Ex TaqTMVersion 2.0(大連寶生物公司),大鼠IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α檢測(cè)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)。

1.2 模型制備及實(shí)驗(yàn)分組

采用4-VO法建立SD大鼠全腦I/R損傷模型。10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉,枕骨下第一頸椎水平正中切口,暴露第一頸椎橫突,通過(guò)翼小孔,燒灼雙側(cè)椎動(dòng)脈并使其閉塞。24 h后,仰臥位取頸部正中切口,暴露并游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉15 min,然后開(kāi)放動(dòng)脈夾恢復(fù)血流灌注。

216只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)+vehicle組(sham組)、I/R+vehicle組(I/R組)、I/R+槲皮素5 mg/(kg·d)組(低劑量組)及I/R+槲皮素10 mg/(kg·d)組(高劑量組)。采用4-VO法建立全腦I/R模型,sham組暴露雙側(cè)椎動(dòng)脈以及頸總動(dòng)脈后予以縫合。四組大鼠均在造模前3 d開(kāi)始灌胃,sham組和I/R組均以0.1%的Tween80(1 ml/100 g)灌胃,低劑量組和高劑量組分別以0.05%[5 mg/(kg·d)]、0.1%[10 mg/(kg·d)]的槲皮素溶液(1 ml/100 g)灌胃,1次/d,持續(xù)至觀察結(jié)束當(dāng)天。

1.3 HE染色觀察海馬CA1區(qū)病理形態(tài)學(xué)變化

每組6只大鼠。再灌注24 h,將灌注針頭插入左心室,4%多聚甲醛的PBS液灌注。開(kāi)顱取腦,分離海馬組織,在4%多聚甲醛溶液中固定24 h,常規(guī)石蠟包埋,HE染色。

1.4 NDS評(píng)估神經(jīng)功能

每組6只大鼠。分別在再灌注12,24,48 h時(shí),根據(jù)Cao等[6]的方法,進(jìn)行NDS評(píng)分。

1.5 干濕重法檢測(cè)腦含水量

每組6只大鼠。分別在再灌注12,24,48 h時(shí),麻醉后處死大鼠,開(kāi)顱取腦,留取左側(cè)大腦半球,測(cè)濕腦組織質(zhì)量(wet weight,WW),烘烤24 h至恒重,稱取干腦組織質(zhì)量(dry weight,DW)。腦組織含水量=(WW-DW)/WW×100%。

1.6 EB法檢測(cè)血腦屏障(BBB)通透性

每組6只大鼠。分別在再灌注12,24,48 h時(shí),麻醉后經(jīng)股靜脈注射2% EB(3 ml/kg),注射后1 h灌注生理鹽水處死。開(kāi)顱取腦,制作2 mm厚冠狀切片,置于二甲基甲酰胺溶液,37 ℃恒溫振蕩水浴箱放置48 h,制作勻漿,10 000g離心20 min,用乙醇按1 ∶3的比例稀釋上清液。用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)632 nm處測(cè)定各標(biāo)本的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出EB含量。

1.7 DCFH-DA法檢測(cè)海馬細(xì)胞活性氧(ROS)含量

每組6只大鼠。分別在再灌注2,12,24 h時(shí),麻醉后處死大鼠,分離海馬組織,滴加4 ℃ PBS溶液,研磨1 min,過(guò)濾,取上清液,2 000g離心5 min,清洗,PBS重新懸浮細(xì)胞,制備1×106/ml的細(xì)胞懸液,加入DCFH-DA探針,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育,采用488 nm為激發(fā)波長(zhǎng),525 nm為發(fā)射波長(zhǎng),檢測(cè)細(xì)胞中熒光強(qiáng)度。根據(jù)DCF的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ROS的水平。

1.8 real-time PCR檢測(cè)海馬組織IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ mRNA水平

1.9 ELISA法檢測(cè)海馬組織和血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ的表達(dá)

每組6只大鼠。分別在再灌注2,12,24,48 h時(shí),麻醉后處死大鼠,取腦,分離海馬組織,制備組織勻漿;麻醉后從心臟抽取靜脈血約5 ml,加入EDTA抗凝管中靜置10 min,2 000 r/min離心20 min,將血清標(biāo)本收集于1.5 ml EP管中。加入50 μl待測(cè)樣品,混勻,溫育60 min,加50 μl酶標(biāo)抗體工作液,37 ℃反應(yīng)90 min,加100 μl底物工作液,暗處反應(yīng)10 min,最后加入終止液50 μl,在492 nm處測(cè)吸光值。根據(jù)吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其含量。

表1 各個(gè)基因引物序列

Table 1 Primer sequences of genes for real-time PCR

基因名稱 引物序列(5′-3′)產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp) IL-6CATTCTGTCTCGAGCCCACC98 GCAACTGGCTGGAAGTCTCT IL-1βCCTTGTCGAGAATGGGCAGT120 CAGGGAGGGAAACACACGTT TNF-αCATCCGTTCTCTACCCAGCC125 CCCAGAGCCACAATTCCCTT IFN-γATGCATTCATGAGCATCGCC104 AGATTCTGGTGACAGCTGGTG β-actinGCAGGAGTACGATGAGTCCG74 ACGCAGCTCAGTAACAGTCC

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 海馬CA1區(qū)病理學(xué)結(jié)果

sham組海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞排列整齊、致密,形態(tài)正常。IR組海馬CA1區(qū)細(xì)胞數(shù)量減少,排列紊亂、稀疏,胞體縮小。與I/R組相比,低劑量組和高劑量組海馬CA1區(qū)損傷明顯減輕,結(jié)構(gòu)較為清晰,細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)較為正常(見(jiàn)圖1)。

2.2 NDS評(píng)分結(jié)果

I/R組12,24,48 h的NDS評(píng)分較sham組顯著下降(P<0.05),而低劑量組及高劑量組NDS評(píng)分均顯著高于I/R組(P<0.05,見(jiàn)圖2)。

2.3 腦組織EB含量檢測(cè)結(jié)果

與sham組相比,I/R組12,24,48 h EB含量顯著升高(P<0.05)。再灌注24 h和48 h,低劑量組和高劑量組EB含量較I/R組顯著降低(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

A.sham組;B.I/R組;C.低劑量組;D.高劑量組圖1 再灌注24 h海馬CA1區(qū)HE染色結(jié)果 (×400)Figure 1 HE staining of hippocampal CA1 at 24 h after reperfusion in different groups (×400)

與sham組相比,*P<0.05;與I/R組相比,#P<0.05圖2 各組再灌注12,24,48 h NDS評(píng)分的比較Figure 2 Comparison of NDS scores at 12, 24 h and 48 h after reperfusion among different groups

與sham組相比,*P<0.05;與I/R組相比,#P<0.05圖3 各組再灌注12,24,48 h EB含量的比較Figure 3 Comparison of EB content at 12, 24 h and 48 h after reperfusion among different groups

2.4 腦含水量檢測(cè)結(jié)果

再灌注12,24,48 h時(shí)I/R組腦組織含水量均顯著高于sham組(P<0.05)。而在24 h和48 h,低劑量組和高劑量組的腦含水量較I/R組顯著降低(P<0.05,見(jiàn)圖4)。

與sham組相比,*P<0.05;與I/R組相比,#P<0.05圖4 各組再灌注12,24,48 h腦含水量的比較Figure 4 Comparison of brain water content at 12, 24 h and 48 h after reperfusion among different groups

2.5 ROS含量檢測(cè)結(jié)果

I/R組再灌注2,12,24 h ROS含量顯著高于sham組(P<0.05);再灌注2 h和12 h,低劑量組和高劑量組ROS含量均顯著低于I/R組(P<0.05),而在24 h,高劑量組則顯著低于I/R組(P<0.05,見(jiàn)圖5)。

2.6 real-time PCR法檢測(cè)海馬組織IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ mRNA結(jié)果

與sham組相比,I/R組IL-1β mRNA、TNF-α mRNA以及IL-6 mRNA在再灌注2,12,24,48 h均顯著升高(P<0.05),高劑量組在各時(shí)點(diǎn)均較I/R組顯著降低(P<0.05);再灌注24 h和48 h,I/R組IFN-γ mRNA較sham組顯著升高(P<0.05),而低劑量組和高劑量組較I/R組顯著降低(P<0.05,見(jiàn)圖6)。

2.7 ELISA法檢測(cè)海馬組織和血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ的表達(dá)的結(jié)果

與sham組相比,I/R組IL-1β、TNF-α以及IL-6在再灌注2,12,24,48 h均顯著升高(P<0.05);與I/R組相比,低劑量組和高劑量組IL-1β、TNF-α、IL-6在再灌注后各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)顯著降低(P<0.05)。再灌注24 h和48 h,I/R組IFN-γ表達(dá)較sham組顯著升高(P<0.05),而低劑量組和高劑量組較I/R組顯著降低(P<0.05,見(jiàn)圖7,8)。

與sham組相比,*P<0.05;與I/R相比,#P<0.05圖5 各組再灌注2,12,24 h海馬細(xì)胞ROS含量的比較Figure 5 Comparison of ROS content in hippocampus cells at 2,12 h and 24 h after reperfusion among different groups

與sham組相比,*P<0.05;與I/R相比,#P<0.05圖6 各組再灌注2,12,24,48 h海馬組織IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ mRNA水平的比較Figure 6 Comparison of mRNA levels of IL-1β, TNF-α, IL-6 and IFN-γ in hippocampus tissue at 2,12, 24 h and 48 h after reperfusion among different groups

3 討論

I/R損傷涉及氧化損傷、炎癥反應(yīng)等一系列病理機(jī)制,是全腦性缺血后功能障礙甚至死亡的重要原因[6]。槲皮素具有抗氧化能力,近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其具有減輕腦I/R損傷的作用,受到研究者的關(guān)注。

已經(jīng)證實(shí),海馬、大腦皮層椎體細(xì)胞、紋狀體和小腦浦肯野細(xì)胞是腦組織內(nèi)對(duì)缺血缺氧最為敏感的區(qū)域或細(xì)胞,尤其是海馬CA1區(qū)[7]。本研究HE染色結(jié)果顯示,I/R組海馬CA1區(qū)組織損傷較重,細(xì)胞排列紊亂,數(shù)量減少,核皺縮,核仁消失,低劑量組和高劑量組細(xì)胞層數(shù)及數(shù)量增多,形態(tài)較為正常,與I/R組相比,CA1區(qū)破壞程度顯著減輕。提示槲皮素能夠減輕全腦I/R導(dǎo)致的組織損傷。

國(guó)際中風(fēng)治療臨床前研究指南指出,在腦缺血性損傷的藥物研究中應(yīng)選擇多重指標(biāo),評(píng)價(jià)應(yīng)包括組織和行為學(xué)結(jié)果。腦I/R損傷后,可出現(xiàn)一系列神經(jīng)行為學(xué)的異常,通常與運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)和認(rèn)知功能障礙等相關(guān),通過(guò)量化統(tǒng)計(jì)動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)差異可間接反映其大腦損傷程度,在腦缺血的研究中非常重要,NDS評(píng)分則屬于神經(jīng)功能缺損評(píng)分。本研究采用NDS來(lái)評(píng)價(jià)大鼠全腦I/R損傷后的神經(jīng)功能。結(jié)果顯示,I/R組大鼠NDS評(píng)分顯著低于sham組,提示全腦I/R后大鼠的神經(jīng)功能受到損傷,而操良斌等[8]學(xué)者的研究結(jié)果亦顯示全腦I/R后大鼠NDS明顯降低,和本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。而低劑量組和高劑量組在再灌注后12 h、24 h和48 h的NDS評(píng)分均顯著高于I/R組,提示槲皮素可以改善全腦I/R導(dǎo)致的大鼠神經(jīng)功能損傷。

與sham組相比,*P<0.05;與I/R相比,#P<0.05圖7 各組再灌注2,12,24 h和48 h海馬組織IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ表達(dá)的比較Figure 7 Comparison of expression of IL-1β, TNF-α, IL-6 and IFN-γ in hippocampus tissue at 2,12, 24 h and 48 h after reperfusion among different groups

與sham組相比,*P<0.05;與I/R相比,#P<0.05圖8 各組再灌注2,12,24 h和48 h血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ水平Figure 8 Comparison of level of IL-1β, TNF-α, IL-6 and IFN-γ in serum at 2,12,24 h and 48 h after reperfusion among different groups

腦缺血性損傷等均可以引起B(yǎng)BB通透性的改變,既是繼發(fā)性損傷,也是損傷的重要機(jī)制[9]。MMPs的活化尤其是MMP-9表達(dá)增加是I/R后導(dǎo)致BBB損傷的重要機(jī)制[10]。在使用MCAO法制備的大鼠局灶性腦缺血模型的研究中,Lee等[11]發(fā)現(xiàn),槲皮素能夠通過(guò)抑制MMP-9的表達(dá)改善大鼠局灶性腦缺血損傷的預(yù)后。腦I/R后BBB遭到破壞,導(dǎo)致血液成分滲入腦組織,形成血管源性腦水腫,與細(xì)胞毒性腦水腫一起加重繼發(fā)性損傷。本實(shí)驗(yàn)使用4-VO制備全腦I/R模型,結(jié)果顯示,再灌注12,24,48 h,I/R組大鼠腦組織EB含量和腦含水量顯著增高,表明全腦I/R損傷后BBB通透性增高,與以往研究結(jié)果一致[12]。而低劑量組和高劑量組在24 h和48 h,EB含量和腦含水量顯著低于I/R組,說(shuō)明槲皮素可有效降低BBB的通透性。

黃酮類的羥基結(jié)構(gòu)決定了其具有清除ROS、鰲合金屬離子等藥理活性。Dai等[14]的研究建立體內(nèi)和體外腦I/R損傷模型,顯示異槲皮素通過(guò)Nrf2-介導(dǎo),抑制NOX4/ROS/NF-κB信號(hào)通路,抑制氧化應(yīng)激和神經(jīng)細(xì)胞凋亡[13]。口服槲皮素負(fù)載的聚合物納米膠囊,通過(guò)抑制ROS,保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能,抑制大鼠腦缺血再灌注損傷ROS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在全腦I/R后2 h,12 h和24 h,I/R組大鼠海馬細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著高于sham組,而低劑量組和高劑量組ROS含量則較I/R組顯著降低,表明槲皮素能夠抑制全腦I/R后ROS的生成,與既往研究結(jié)果一致。證實(shí)了槲皮素能夠抑制全腦I/R損傷后的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

隨著關(guān)于腦I/R損傷免疫機(jī)制研究的深入,炎癥細(xì)胞和炎性因子在腦I/R損傷中的作用日益受到關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn),槲皮素治療聯(lián)合人臍帶間充質(zhì)質(zhì)細(xì)胞移植,抑制促炎因子IL-1β和IL-6,增加IL-4、IL-10和TGF-β1,可顯著改善局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)[15]。Wang等[4]的研究觀察異槲皮素在原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元的氧糖剝奪再灌注模型和大鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注模型的神經(jīng)保護(hù)作用,結(jié)果表明,異槲皮素通過(guò)抑制TLR4,NF-κB和caspase-1的激活,ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化,抑制TNF-α、IL-1β和IL-6,調(diào)控Bax、Bcl-2和caspase-3的表達(dá),降低I/R損傷后的梗死面積、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及凋亡細(xì)胞數(shù)量。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與I/R組相比,低劑量組的IL-1β mRNA在48 h,TNF-α mRNA在2 h,IL-6 mRNA在2 h和12 h,與I/R組相比無(wú)顯著性差異,其余各時(shí)間點(diǎn)mRNA水平以及各時(shí)間點(diǎn)蛋白表達(dá)均較I/R組顯著降低。高劑量組在各時(shí)間點(diǎn)IL-1β、TNF-α以及IL-6 mRNA水平和蛋白水平均顯著低于I/R組。ELISA檢測(cè)海馬組織和血清結(jié)果亦表明,低劑量組和高劑量組IL-1β、TNF-α、IL-6在再灌注后各時(shí)間點(diǎn)較I/R組顯著降低。提示槲皮素可抑制全腦I/R損傷后IL-1β、TNF-α以及IL-6的表達(dá)。

I/R后,炎癥因子既可以在腦組織內(nèi)產(chǎn)生,也可以來(lái)源于外周免疫系統(tǒng)。Chang等[16]在局灶性腦缺血模型發(fā)現(xiàn),腦缺血后IFN-γ在腦組織和外周血中表達(dá)均升高,與損傷關(guān)系密切。Seifert等[17]在局灶性腦缺血模型發(fā)現(xiàn),來(lái)源于脾臟的IFN-γ加重了腦組織損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示I/R組大鼠腦組織中IFN-γ mRNA在全腦I/R后2 h和12 h與sham組無(wú)顯著性差異,24 h開(kāi)始升高,而在血清和腦組織出現(xiàn)同樣的結(jié)果。說(shuō)明腦組織增多的IFN-γ可能來(lái)源于外周免疫系統(tǒng),BBB受損后進(jìn)入腦組織。同時(shí)ELISA檢測(cè)海馬組織和血清結(jié)果發(fā)現(xiàn)低劑量組和高劑量組IFN-γ在24 h和48 h的表達(dá)較I/R組明顯降低。說(shuō)明槲皮素也可以抑制IFN-γ的表達(dá)。

綜上所述,槲皮素能夠改善大鼠全腦I/R后神經(jīng)功能損傷,減輕血腦屏障損傷和腦水腫,減少ROS生成,抑制IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ的表達(dá),減輕組織損傷。