劉 寧,郭 芳,黃 碩

(西安醫(yī)學院口腔醫(yī)學院口腔頜面外科學教研室,西安 710021;*通訊作者,E-mail:ningliu@xiyi.edu.cn)

牙齒拔除后牙槽嵴的吸收改建及上頜竇氣化現(xiàn)象的存在,常導致患者牙槽嵴寬度、高度不足,限制種植體的植入。促進骨再生的方法包括自體骨移植、異體骨移植及以細胞為基礎的骨組織工程技術。自體骨移植是骨組織缺損修復的金標準,然而口腔內種植區(qū)可利用的自體骨量有限,異位取骨又伴隨多種并發(fā)癥,因此骨組織工程技術具有廣闊的應用前景。淫羊藿苷(icariin,ICA)是從淫羊藿中提取出來的一種黃酮類化合物,是淫羊藿的主要有效成分之一,對于骨損傷修復治療具有較好的促進療效,可作為一種骨誘導活性因子用于骨組織的修復再生[1-3]。已有研究報道,ICA可通過ERK和p38MAPK信號通路促進骨髓間充質干細胞增殖[4],并通過ERα-Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路促進骨髓間充質干細胞向成骨方向分化[5]。骨組織工程領域中脂肪干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)具有體內存在范圍廣、容易獲取且創(chuàng)傷小的優(yōu)點被廣泛研究和應用[6-8]。本研究擬探討ICA對ADSCs成骨分化的作用,為其在骨再生領域的應用提供實驗室依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

2周齡雄性C57BL/6J小鼠4只,由空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑和儀器

淫羊藿苷(源葉生物科技有限公司,中國),α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS緩沖液(Hyclone公司,美國),Trizol、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、FastStart Universal SYBR Green Master(Roche公司,瑞士),基因引物(Life technology公司,中國),OCN抗體、熒光二抗(Abcam公司,英國)。倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(SONY公司,日本),PCR擴增儀(Bio-Rad公司,美國),實時熒光定量PCR基因擴增儀(Roche公司,瑞士)。

1.3 脂肪干細胞的分離、培養(yǎng)及形態(tài)學觀察

2周齡雄性C57BL/6J小鼠4只過量戊巴比妥鈉麻醉處死,無菌取雙側腹股溝脂肪組織,置于培養(yǎng)皿中,清除外包膜及肉眼可見的小血管,PBS清洗后剪碎成約為1 mm3組織塊,加入0.075%的膠原酶37 ℃振蕩消化60 min。待消化完成后,1 000 r/min離心5 min。棄上清,向離心管內加入2 ml含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液,1 000 r/min離心5 min。加入5 ml培養(yǎng)液重懸,將懸液接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內,置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d換液,顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。細胞融合度達到80%時傳代,將細胞培養(yǎng)至第3代,進行后續(xù)實驗。

1.4 成骨誘導及成脂誘導

取第3代ADSCs,消化后以1×105個/孔的密度接種于6孔板中培養(yǎng)。當細胞達到60%-70%融合度時,向6孔板中加入2 ml脂肪間質干細胞成骨誘導分化培養(yǎng)液,成骨誘導21 d。當細胞達到100%融合時,吸棄培養(yǎng)液,向孔板中加入2 ml成脂誘導分化培養(yǎng)液,成脂誘導18 d。4%多聚甲醛溶液固定30 min,PBS漂洗3遍。成骨誘導細胞茜素紅染液常溫染色15 min,成脂誘導細胞油紅O染料工作液染色30 min,PBS漂洗3遍,將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察染色效果。

1.5 成骨相關基因檢測

取第3代ADSCs,以1×105個/孔的密度接種于6孔板,含濃度為10-7mol/L ICA的培養(yǎng)液培養(yǎng)作為實驗組,單純培養(yǎng)液培養(yǎng)作為對照組,培養(yǎng)7 d,使用Trizol分別提取各組細胞的總RNA,按照逆轉錄試劑盒的操作步驟逆轉錄得到cDNA,并對逆轉錄產物進行實時熒光定量RT-PCR,檢測成骨相關基因Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的表達水平,成骨相關基因特異性引物序列見表1。反應條件:95 ℃反應30 s,1個循環(huán);95 ℃反應5 s,60 ℃反應34 s,40個循環(huán)。以GAPDH作為內參,統(tǒng)計Runx2、OPN、ALP的相對表達量。

表1 成骨相關基因特異性引物序列

Table 1 The primer sequences of osteogenic-related genes

基因 上游序列(5′-3′) 下游序列(5′-3′)Runx2CCAACCCACGAATGCACTATCTAGTGAGTGGTGGCGGACATACOPNAGCAAGAAACTCTTCCAAGCAAGTGAGATTCGTCAGATTCATCCGALPGCCCTCTCCAAGACATATACCATGATCACGTCGATATCCGAPDHGACGGCCGCATCTTCTTGTGCTGCAAATGGCAGCCCTGGTGA

1.6 免疫熒光檢測

取第3代ADSCs,消化后以105個/孔的密度接種于6孔板中,含濃度為10-7mol/L ICA的培養(yǎng)液培養(yǎng)作為實驗組,單純培養(yǎng)液培養(yǎng)作為對照組,培養(yǎng)7 d,4%多聚甲醛固定2 h。PBS漂洗3次,0.1% Triton-X100室溫孵育30 min。PBS漂洗3次,5% BSA封閉液室溫孵育20 min。甩去多余液體,分別加入5 μg/ml骨鈣素(osteocalcin,OCN)抗體液0.2 ml,4 ℃過夜。吸棄一抗液體,PBS漂洗3次,加入驢抗兔熒光二抗,37 ℃孵育20 min。PBS漂洗3次,滴加抗熒光淬滅封片劑,蓋玻片封片,激光顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計學分析

使用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學分析,計量數據以均數±標準差表示,實驗結果采用兩獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析,以雙側P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 脂肪干細胞形態(tài)學觀察

原代細胞培養(yǎng)3 d,顯微鏡下觀察ADSCs呈簇分布,大部分細胞呈纖維細胞樣梭形,突起細長,部分細胞呈多邊形(見圖1)。

圖1 ADSCs的細胞形態(tài) (×100)Figure 1 The morphology of ADSCs (×100)

2.2 成骨誘導茜素紅染色及成脂誘導油紅O染色

ADSCs成骨誘導21 d,茜素紅染色,顯微鏡下觀察可見大量散在分布的紅棕色礦化結節(jié)(見圖2A)。ADSCs成脂誘導18 d,油紅O染色,顯微鏡下觀察可見細胞胞質內含有大量大小不等的橘紅色圓形脂滴(見圖2B)。

A.茜素紅染色(×100) B.油紅O染色(×200)圖2 ADSCs成骨誘導茜素紅染色和成脂誘導油紅O染色Figure 2 Alizarin red staining of ADSCs osteogenesis and Oil red O staining of ADSCs lipogenic induction

2.3 成骨分化相關基因表達

實驗組用含濃度為10-7mol/L ICA的培養(yǎng)液培養(yǎng),對照組用單純培養(yǎng)液培養(yǎng),培養(yǎng)7 d。RT-PCR方法檢測ICA實驗組成骨相關基因Runx2、OPN、ALP的表達水平顯著高于培養(yǎng)基對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖3)。

與對照組比較,*P<0.05圖3 成骨相關基因Runx2、OPN、ALP的RT-PCR檢測Figure 3 Levels of Runx2, OPN and ALP in two groups by RT-PCR (*P<0.05)

2.4 OCN免疫熒光檢測

實驗組用含濃度為10-7mol/L ICA的培養(yǎng)液培養(yǎng),對照組用單純培養(yǎng)液培養(yǎng),培養(yǎng)7 d，ICA實驗組OCN蛋白的表達強于培養(yǎng)基對照組(見圖4)。

圖4 OCN蛋白免疫熒光表達 (×100)Figure 4 The expression of OCN protein by immunofluorescence staining (×100)

3 討論

骨組織工程在治療骨缺損、促進骨再生等領域具有重要的意義。Kaplan等[9]發(fā)現(xiàn)皮下脂肪組織具有異位成骨現(xiàn)象,提出“脂肪組織中具有成骨分化潛能細胞”。進一步研究發(fā)現(xiàn),ADSCs具有多向分化潛能,與BMSCs相比具有更強的增殖能力,在轉錄水平上具有與BMSCs十分相似的基因型和表現(xiàn)型[10]。多項研究證實ADSCs可直接向成骨細胞分化或通過旁分泌促進骨組織再生[11-13]。因此,基于ADSCs的骨組織重建與再生技術是目前骨組織工程領域的又一研究方向,具有廣闊的應用前景。

大量研究表明,ICA在抑制骨質疏松和促進間充質干細胞成骨方面發(fā)揮作用。ICA可通過促進成骨細胞成骨相關基因的表達,從而促進成骨細胞的分化和成骨作用,并且抑制破骨細胞活性,從而促進正骨平衡,對骨質疏松有預防作用[14,15]。目前,ICA對骨髓間充質干細胞的成骨作用研究較多。研究發(fā)現(xiàn)ICA可通過Notch信號途徑、Wnt信號途徑、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2等信號途徑促進骨髓間充質干細胞成骨分化,而對其他來源的間充質干細胞的研究相對較少[16]。

本研究擬探討ICA對ADSCs的成骨分化促進作用。首先對C57BL/6J雄鼠的腹股溝脂肪組織進行分離培養(yǎng),鏡下觀察多數細胞呈纖維細胞樣梭形。多向分化潛能是干細胞的重要生物學特性之一,成骨和成脂分化是干細胞的兩個基本分化方向,是目前公認的用于鑒定干細胞分化功能的方法。將培養(yǎng)細胞進行成骨和成脂誘導,誘導一段時間后可見細胞間出現(xiàn)大量的礦化結節(jié)和脂滴,表明培養(yǎng)細胞具備多向分化潛能。Runx2是成骨分化的核心調控基因,是骨形成過程中最早出現(xiàn)、最具特異性的標志基因之一,研究顯示Runx2基因敲除能顯著抑制小鼠的成骨細胞發(fā)育[17]。OPN為成骨細胞分泌的非膠原蛋白,ALP的檢測是最常見的測量成骨活性的指標之一。實驗采用RT-PCR檢測成骨相關基因Runx2、OPN、ALP的表達,實驗結果顯示ICA刺激組各檢測基因的表達均顯著高于培養(yǎng)基對照組(P<0.05)。檢測細胞內OCN蛋白含量的表達,ICA刺激組OCN蛋白的表達強于培養(yǎng)基對照組,進一步證實ICA可促進ADSCs的成骨分化。然而,ICA對ADSCs成骨分化的具體作用機理仍然需要進一步的研究。

綜上所述,淫羊藿苷具有促進脂肪干細胞的成骨分化的作用。下一階段將重點研究淫羊藿苷對脂肪干細胞成骨分化作用的分子機制,為其應用于臨床骨再生治療提供實驗依據。