吳文婧,趙車冬,龐 歡,趙 華,申 濤,陳 葳

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:chenweixjtu2014@126.com)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤,全球范圍內(nèi)每年新增的膀胱癌患者超過33萬例,死亡病例多于3萬例[1]。在我國,膀胱癌發(fā)病率在泌尿系統(tǒng)中居于首位,且呈逐年上升趨勢,嚴(yán)重威脅人類的健康和生命[2,3]。膀胱癌生物學(xué)行為復(fù)雜,且治療后易復(fù)發(fā),容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移,其發(fā)病機制涉及大量基因表達、功能異常及多種信號通路的改變。環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)是具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一類新型RNA[4]。近年來,circRNA被發(fā)現(xiàn)與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病相關(guān),通過多種機制參與疾病的發(fā)生發(fā)展[5-7]。但是與膀胱癌相關(guān)的circRNA目前研究尚不多見[8]。

本研究基于基因表達數(shù)據(jù)庫(GEO),利用生物信息學(xué)方法對膀胱癌相關(guān)circRNA進行篩選,并對其相關(guān)通路進行預(yù)測。本研究結(jié)果對于深入研究膀胱癌的分子機制,尋找新的診斷標(biāo)志物和有效治療靶點,提供了一定研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

從GEO數(shù)據(jù)庫中篩選含有膀胱癌和癌旁組織基因表達信息的數(shù)據(jù)集,發(fā)現(xiàn)膀胱癌circRNA表達譜數(shù)據(jù)集GSE92675,該數(shù)據(jù)集來自Agilent-069978 Arraystar Human CircRNA microarray V1芯片數(shù)據(jù)共8張,分別為4例膀胱癌組織和4例配對的癌旁組織,該芯片可檢測5 397條circRNA。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)來源 從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載膀胱癌circRNA表達譜數(shù)據(jù)集GSE92675的數(shù)據(jù),使用R軟件包對GEO92675芯片數(shù)據(jù)進行分析,通過差異表達倍數(shù)和P值進行篩選,采用t檢驗,篩選兩組樣本間差異表達的circRNA。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 通過生物信息學(xué)網(wǎng)站(http://www.circbase.org;http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測與上調(diào)或者下調(diào)表達的circRNA相互作用的靶microRNA。應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建circRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)。使用FunRich軟件對microRNA的靶基因進行預(yù)測并進行基因本體論(gene ontology,GO)生物學(xué)通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌中差異表達circRNA的篩選

將腫瘤組和正常組芯片分析數(shù)據(jù)進行比較,從芯片數(shù)據(jù)中篩選出3 423個差異表達的circRNA,首先對校正的P值進行篩選,篩選條件為P校正<0.01,經(jīng)過篩選,得到670個circRNA。再通過篩選差異表達倍數(shù)(fold change,FC),選擇|logFC|>1.5的circRNA,得到153個circRNA,其中表達上調(diào)的有114個circRNA,表達下調(diào)的circRNA有39個(見圖1)。膀胱癌中上調(diào)10倍以上的circRNA,及表達下調(diào)10倍以上的circRNA見表1、2。

2.2 差異表達circRNA在芯片所用組織中的表達譜

選取表達上調(diào)和下調(diào)差異倍數(shù)前5位的circRNA,從GEO數(shù)據(jù)庫中調(diào)取其表達量,如圖2所示,has-circ-0000144、0000658、0023642、0002623、0032821在膀胱癌組織中高表達,而has-circ-0003266、0092342、0007158、0028173、0009361在膀胱癌組織中的表達低于癌旁正常組織。

藍色點代表符合篩選條件的circRNA P校正<0.01,|logFC|>1.5,紅色點代表不符合篩選條件的circRNA圖1 膀胱癌差異表達circRNA火山圖Figure 1 Volcano plots of differentially expressed circRNAs of bladder cancer

表1 膀胱癌中表達上調(diào)10倍以上的circRNA

Table 1 Upregulated circRNAs with over 10 fold change in bladder cancer

circRNA相關(guān)基因倍數(shù)Phsa-circ-0000144SLAMF653.640.000000924hsa-circ-0000658MCTP249.990.00000013hsa-circ-0023642UVRAG40.500.000000112hsa-circ-0002623VANGL139.360.000000916hsa-circ-0032821CEP12833.740.00000328hsa-circ-0008035EXT131.760.000000924hsa-circ-0005273PTK230.890.000073hsa-circ-0084171FNTA30.790.00000186hsa-circ-0058058ATIC29.300.000000924hsa-circ-0061265None26.570.00000226hsa-circ-0001336EEFSEC21.870.00146hsa-circ-0041103TCF2521.360.00000264hsa-circ-0047322TAF4B20.200.00000013hsa-circ-0072088ZFR15.520.0000756hsa-circ-0008558LONP214.380.00000013hsa-circ-0041151RPH3AL12.630.00000013hsa-circ-0011385EIF3I12.080.00000583hsa-circ-0060219SOGA111.110.0000053hsa-circ-0000520RPPH110.480.000225hsa-circ-0003528SEC24A10.450.00067

表2 膀胱癌中表達下調(diào)10倍以上的circRNA

Table 2 Down-regulated circRNAs with over 10 fold change in bladder cancer

circRNA相關(guān)基因倍數(shù)Phsa-circ-0003266LRIG117.330.0000876hsa-circ-0092342RPL27A14.230.000265hsa-circ-0007158FAM169A10.470.0000613hsa-circ-0028173ATP2A210.370.0000136

圖2 差異表達circRNA在芯片所用組織中的表達Figure 2 Expression of circRNAs with differentially expression in the tissues of chip

2.3 circRNA-SOGA1的生物信息學(xué)分析結(jié)果

對上調(diào)或下調(diào)的circRNA進行相關(guān)文獻檢索分析,發(fā)現(xiàn)上調(diào)倍數(shù)為11倍的circRNA-SOGA1的相關(guān)基因SOGA1(suppressor of glucose 1)可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,因此對circRNA-SOGA1作進一步分析。通過生物信息學(xué)網(wǎng)站starbase預(yù)測與circRNA相互作用的靶microRNA,結(jié)果提示與circRNA-SOGA1相互作用的miRNA有103個,利用Cytoscape構(gòu)建其circRNA-miRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)(見圖3A)。FunRich軟件對該103個miRNA的靶基因進行預(yù)測,并進行GO分析,分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),這些miRNA的靶基因主要參與蛋白多糖介導(dǎo)的信號通路、ErbB受體信號通路、VEGF和VEGFR信號通路等(圖3B)。

3 討論

近年來,隨著膀胱癌發(fā)病率的逐年增長,如何阻止膀胱癌的發(fā)生發(fā)展是其治療的關(guān)鍵問題,積極探究膀胱癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機制并尋找新的治療靶點具有十分重要的意義。

研究表明,circRNA可以作為miRNA的分子海綿,通過吸附miRNA,促進miRNA的靶基因的表達[9]。在本研究中,我們通過分析GEO數(shù)據(jù)庫中膀胱癌相關(guān)的circRNA數(shù)據(jù)集,對膀胱癌相關(guān)circRNA進行篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達上調(diào)的有114個circRNA,表達下調(diào)的circRNA有39個。提示circRNA可能參與了膀胱癌的進展。有研究發(fā)現(xiàn)circRNA在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[10,11],可以通過circRNA-miRNA-mRNA軸促進或抑制膀胱癌細胞的生長和進展。本研究中利用生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)的在膀胱癌組織上調(diào)或下調(diào)的circRNA是否在膀胱癌中發(fā)揮作用仍需進一步實驗驗證。

圖3 circ-SOGA1調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析Figure 3 Analysis of circ-SOGA1 regulatory network

本研究中,我們對上調(diào)倍數(shù)為11倍的circ-SOGA1作進一步的深入分析。circ-SOGA1定位于20號染色體,其相關(guān)基因為SOGA1,目前對SOGA1的研究尚不多見。有研究發(fā)現(xiàn),SOGA1在腫瘤干細胞中可以增加線粒體的生物合成,從而增加線粒體質(zhì)量[12]。SOGA1還表達于人乳頭瘤病毒197型E6和E7相關(guān)細胞蛋白[13]。Kruse等[14]在研究微管相關(guān)蛋白CLASP2蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)時,發(fā)現(xiàn)SOGA1與CLASP2和tubulin共定位,證實SOGA1可能作為一種新的微管相關(guān)蛋白發(fā)揮細胞骨架的代謝功能。Habieb等[15]的研究探討血循環(huán)中的RNA在肝細胞癌中的診斷作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清SOGA1 mRNA在肝癌患者中表達升高,是肝細胞癌的一個獨立預(yù)后因素。但是SOGA1在膀胱癌中的功能尚需進一步研究。circ-SOGA1是來源于SOGA1的環(huán)狀RNA,在膀胱癌中是否發(fā)揮作用還需要進一步實驗證實。而我們進一步對circRNA-SOGA1預(yù)測其相互作用的miRNA和靶基因,構(gòu)建circRNA-miRNA互作網(wǎng)絡(luò),并對相關(guān)靶基因進行GO分析,結(jié)果顯示這些靶基因在膀胱癌細胞中可能參與蛋白多糖、ErbB受體、VEGF和VEGFR信號通路等多條信號通路。因此推測circRNA-SOGA1可能通過影響靶miRNA的活性或競爭結(jié)合靶miRNA來調(diào)節(jié)miRNA與靶mRNA的作用,進而通過多種信號通路和生物進程來影響膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。但是生物學(xué)信息分析結(jié)果仍需經(jīng)過實驗驗證,后續(xù)研究中我們將對circ-SOGA1在膀胱癌細胞中進行功能學(xué)驗證,并闡明其參與的信號通路。

綜上所述,本研究構(gòu)建了膀胱癌相關(guān)circRNA的互作網(wǎng)絡(luò),為揭示膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子機制提供一定的理論基礎(chǔ)。對circRNA功能及作用機制的研究,有助于探尋新的膀胱癌候選診斷、治療靶點,并揭示膀胱癌進展過程中的生物學(xué)機制。