甘 露,劉曉英,王雯智,魏 榮

(1陜西省人民醫(yī)院,西安交通大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科,西安 710068;2陜西省榆林市第二醫(yī)院婦產(chǎn)科)

在我國(guó),宮頸癌是婦科第二大腫瘤,浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要因素[1]。因此探討宮頸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的機(jī)制具有十分重要的臨床意義。TGF-β1是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β,TGFβ)超家族成員之一,既往研究表明TGF-β1能夠促進(jìn)宮頸癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[2,3]。越來(lái)越多的研究表明TGF-β1與miRNAs相互影響、共同致病[4,5]。但是,TGF-β1對(duì)宮頸癌Siha細(xì)胞miRNA的調(diào)控作用國(guó)內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究利用miRNA芯片技術(shù),檢測(cè)TGF-β1作用后宮頸癌Siha細(xì)胞miRNA的差異表達(dá),從miRNAs水平探討TGF-β1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,為宮頸癌的臨床靶向治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 一般材料

宮頸癌Siha細(xì)胞由空軍軍醫(yī)大學(xué)藥物基因組學(xué)教研室饋贈(zèng)。細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑 Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司);TGF-β1,胎牛血清,RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega);miRNA芯片(美國(guó)Affymetrix公司);熒光定量PCR試劑盒(日本TOYOBO);ABI Prism 7500熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)分為兩組:TGF-β1干預(yù)組和對(duì)照組。待宮頸癌Siha細(xì)胞長(zhǎng)至70%融合度時(shí),干預(yù)組加入10 ng/ml的TGF-β1,繼續(xù)培養(yǎng)48 h然后進(jìn)行下一步基因芯片篩選。對(duì)照組不予以TGF-β1處理,繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48 h然后進(jìn)行下一步基因芯片篩選。

1.2.4 qRT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果 選擇其中差異倍數(shù)大的miRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。Trizol抽提細(xì)胞總RNA,總RNA質(zhì)檢合格后,按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

Table 1 Primer sequences of PCR

miRNA 序列 hsa-miR-494-3p-F5′-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3′hsa-miR-378a-5p-F5′-CTCCTGACTCCAGGTCCTGTG-3′miRNA-R5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′U6-F5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′U6-R5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′

PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min,[95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 32 s]共40個(gè)循環(huán)。ΔCt干預(yù)組=Ct干預(yù)組-CtU6干預(yù)組,ΔCt對(duì)照組=Ct對(duì)照組-CtU6對(duì)照組,ΔΔCt=ΔCt干預(yù)組-ΔCt對(duì)照組,miRNA的相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt形式表示,每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 運(yùn)用Target Scan軟件預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA的靶基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA芯片結(jié)果初步篩選芯片結(jié)果

初步篩選TGF-β1處理48 h差異表達(dá)的miRNA,見圖1。篩選原則為:FDR控制在5%內(nèi),差異倍數(shù)為2倍以上。miRNAs的表達(dá)譜存在39個(gè)相同的差異表達(dá)miRNA,其中27個(gè)表達(dá)上調(diào),12個(gè)表達(dá)下調(diào)(見表2,3)。

圖1 TGF-β1處理宮頸癌Siha細(xì)胞48 h miRNA芯片掃描圖Figure 1 The miRNA chip scan of Siha cells after treatment of TGF-β1 for 48 h

表2 TGF-β1處理宮頸癌Siha細(xì)胞48 h表達(dá)上調(diào)的miRNAs

Table 2 Up-regulated miRNAs of Siha cells after treatment with TGF-β1 for 48 h

序號(hào)名稱 倍數(shù)1hsa-let-7f-5p3.19712hsa-miR-21-5p3.26053hsa-miR-29b-1-5p2.7514hsa-miR-196a-5p2.58845hsa-miR-183-5p2.70686hsa-miR-203a2.51647hsa-let-7g-5p2.70488hsa-miR-128-3p2.43449hsa-miR-140-5p2.210610hsa-miR-125a-3p3.283911hsa-miR-365a-5p2.369712hsa-let-7d-3p2.568613hsa-miR-196b-5p2.105714hsa-miR-494-3p5.639215hsa-miR-181d-5p3.156516hsa-miR-519c-5p2.907117hsa-miR-519b-5p2.907118hsa-miR-523-5p2.907119hsa-miR-518e-5p2.907120hsa-miR-522-5p2.907121hsa-miR-519a-5p2.907122hsa-miR-1229-5p5.035823hsa-miR-12902.441824hsa-miR-12463.031425hsa-miR-42864.555726hsa-miR-3613-5p4.738327hsa-miR-23c2.2014

表3 TGF-β1處理宮頸癌Siha細(xì)胞48 h表達(dá)下調(diào)的miRNAs

Table 3 Down-regulated miRNAs of Siha cells after treatment with TGF-β1 for 48 h

序號(hào)名稱 倍數(shù)1hsa-miR-192-5p0.35272hsa-miR-216a-5p0.48373hsa-miR-15b-3p0.36934hsa-miR-188-5p0.42245hsa-miR-378a-5p0.19416hsa-miR-625-5p0.40057hsa-miR-1296-5p0.3448hsa-miR-874-3p0.49499hsa-miR-12310.462610hsa-miR-43140.487911hsa-miR-3613-3p0.241312hsa-miR-3682-3p0.4267

2.2 qRT-PCR驗(yàn)證TGF-β1處理宮頸癌Siha細(xì)胞miR-494-3p及miR-378a-5p的表達(dá)

TGF-β1作用48 h后宮頸癌Siha細(xì)胞miR-494-3p的表達(dá)顯著增加(t=15.88,P=0.003 9);TGF-β1作用48 h后宮頸癌Siha細(xì)胞miR-378a-5p的表達(dá)顯著降低(t=19.50,P=0.002 6,見圖2)。

2.3 miR-494-3p及miR-378a-5p靶基因預(yù)測(cè)

通過Target Scan軟件預(yù)測(cè)miR-494-3p及miR-378a-5p可以調(diào)控眾多的靶基因,其中還含有共同的靶基因,如結(jié)腸腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli, APC)、缺氧誘導(dǎo)因子-1A(hypoxia inducible factor-1A, HIF1A)等,見表4。

與對(duì)照組比較,**P<0.01圖2 TGF-β1處理宮頸癌Siha細(xì)胞miR-494-3p/miR-378a-5p的差異表達(dá)Figure 2 Differential expression of miR-494-3p/miR-378a-5p in Siha cell treated by TGF-β1

表4 miR-494-3p及miR-378a-5p靶基因預(yù)測(cè)

Table 4 Target gene prediction of miR-494-3p and miR-378a-5p

名稱靶基因 miR-494-3pPTEN,TNFRSF9,CADM1,IRS1,CDK4,IGF1R,IGF1,IRAK3,SAMD1,HIF1A,APC,FUT8,SIRT1,等miR-378a-5pFSHR,E2F3,EZH2,APC,MMP15,TLR5,HIF1A,IL6R,IRF1,BCL2,ESR1,GHR,SMAD3,EGFR,TEF等

下劃線表示共同調(diào)控的基因

3 討論

浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致宮頸癌患者死亡的主要因素,因此研究宮頸癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制、探索防治宮頸癌轉(zhuǎn)移的方法,具有重大的臨床意義。既往研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理后宮頸癌Siha細(xì)胞具有強(qiáng)的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力[6,7]。

miRNA是一類非編碼小RNA,大量研究發(fā)現(xiàn)其有望用作腫瘤和其他疾病的分子靶向治療的新分子靶標(biāo)。本文采用miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)TGF-β1處理前后宮頸癌Siha細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的變化,共發(fā)現(xiàn)39個(gè)差異表達(dá)的miRNA,其中27個(gè)表達(dá)上調(diào),12個(gè)表達(dá)下調(diào)。選擇其中差異倍數(shù)大的2個(gè)miRNA(hsa-miR-494-3p,hsa-miR-378a-5p)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果與芯片結(jié)果一致。這些結(jié)果表明差異miRNA的改變由TGF-β1刺激所導(dǎo)致,而且可能經(jīng)由TGF-β信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。

通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-494-3p及miR-378a-5p可以調(diào)控眾多的靶基因,其中還含有共同的靶基因,如結(jié)腸腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli, APC)、缺氧誘導(dǎo)因子-1A(hypoxia inducible factor-1A, HIF1A)等。

miR-494在不同類型的腫瘤中的作用不同。miR-494在結(jié)直腸癌組織中明顯上調(diào),而這一增加與APC表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。APC被證實(shí)是結(jié)直腸癌中miR-494的直接靶點(diǎn)。此外,過表達(dá)miR-494促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)[8]。在A549肺癌細(xì)胞中,miR-494-3p的過表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的形成,增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的活力,增加了干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)[9]。miR-494可通過直接靶向TET1抑制基因組DNA的去甲基化,從而觸發(fā)多種侵襲抑制基因沉默,最終導(dǎo)致腫瘤血管的侵襲[10]。但在軟骨肉瘤中,miR-494的作用則相反,它通過直接靶向SOX9抑制體內(nèi)和體外軟骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[11]。

在乳腺癌組織中miR-378a-3p的表達(dá)水平較低,并與患者預(yù)后不良有關(guān)。miR-378a-3p通過靶向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1A調(diào)節(jié)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的三苯氧胺敏感性[12]。miR-378的降低促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展和血管生成[13]。miR-378a-3p可能作為腫瘤抑制因子在橫紋肌肉瘤中發(fā)揮作用,其表達(dá)的恢復(fù)在橫紋肌肉瘤中具有治療作用[14]。最新的研究發(fā)現(xiàn),miR-378a-3p可能作為腫瘤抑制因子,與腎癌患者的預(yù)后相關(guān),高表達(dá)miR-378a-3p的患者生存期會(huì)增加[15]。但在宮頸癌中miR-494-3p及miR-378a-5p未見相關(guān)報(bào)道。

我們推測(cè)這些差異表達(dá)的miRNAs參與宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程,具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。