禹 樂,朱啟淦,溫路生,魁國菊,楊立民,孟加榕,陳淑敏

(1聯(lián)勤保障部隊(duì)第909醫(yī)院,廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院病理科,漳州 363000;2漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院病理學(xué)教研室;*通訊作者,E-mail:1274801787@qq.com)

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最為常見的一類惡性腫瘤,甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)是其最常見的病理類型,約占80%-90%。近年來隨著高頻彩超的廣泛應(yīng)用,腫塊直徑≤10 mm的甲狀腺微小乳頭狀癌(papillary thyroid microcarcinoma,PTMC)檢出率呈明顯的增長趨勢[1]。以往認(rèn)為PTMC的生物學(xué)行為較溫和,死亡率較低,但早期仍可見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,使初次手術(shù)的方式和術(shù)后的治療存在爭議。鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1(V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)基因突變是甲狀腺癌中最常見的遺傳學(xué)事件,BRAFV600E基因突變與PTC的高侵襲性密切相關(guān)[2,3],但對于原發(fā)灶很小的PTMC的報(bào)道相對較少。本研究旨在探討B(tài)RAFV600E基因突變情況與PTMC臨床病理特征的相關(guān)性,為PTMC患者的臨床管理和預(yù)后提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2012-01～2018-12期間在聯(lián)勤保障部隊(duì)第909醫(yī)院收治的臨床資料完整的PTMC手術(shù)患者作為研究對象,所有患者均符合無甲狀腺病史和甲狀腺相關(guān)藥物服用史,接受患側(cè)甲狀腺葉全切、峽部切除或全甲狀腺切除術(shù),并行預(yù)防性患側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃;所選病例的術(shù)后標(biāo)本均由兩名高年資病理醫(yī)生診斷,疑難病例由多名病理診斷醫(yī)生共同討論后診斷,最終收集符合標(biāo)準(zhǔn)病例共173例?；颊叩哪[瘤分期采用美國癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)2017年第8版本的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器

石蠟切片(FFPE)核酸提取試劑盒、人類BRAF基因V600E突變檢測試劑盒(熒光PCR)均購于廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司,主要儀器是美國ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.3 DNA提取與檢測

取7-8 μm厚的石蠟切片1-5片至1.5 ml離心管中,組織樣本的DNA提取按照石蠟切片核酸提取試劑盒提供的說明書進(jìn)行操作,應(yīng)用紫外分光光度計(jì)對提取DNA的樣本的濃度與質(zhì)量,濃度大于2 ng/μl,OD260/OD280比值范圍在1.6-2.2之間,OD260/OD230比值大于1.6為合格DNA樣本。

1.4 檢測原理

本實(shí)驗(yàn)所用試劑盒是基于突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(Amplification Refractory Mutation System, ARMS)和熒光PCR技術(shù)來實(shí)現(xiàn)樣本DNA中BRAFV600E基因突變的檢測。其原理是針對BRAFV600E基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異的突變檢測引物,在PCR擴(kuò)增時(shí),由于該引物3′末端的堿基與突變型模板完全配對,引物延伸并擴(kuò)增出突變模板,而與野生型模板由于不能完全配對,引物的延伸被阻斷,野生型模板擴(kuò)增被抑制,擴(kuò)增的同時(shí)利用FAM標(biāo)記的雙環(huán)探針熒光探針對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測,從而實(shí)現(xiàn)BRAFV600E基因突變的檢測。

1.5 檢測主要步驟

取出檢測試劑置于室溫中平衡10 min,待其完全融化后短暫離心,并置于冰盒上,取35 μl反應(yīng)混合液加入到PCR反應(yīng)管中,依次加入0.4 μl Taq酶、5 μl稀釋為2 ng/μl的待檢DNA樣品,用同樣的方法建立陰性、陽性對照,離心PCR反應(yīng)管,使所加的試劑聚集到反應(yīng)管的底部,最后將PCR反應(yīng)管置于ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中反應(yīng);循環(huán)條件為95 ℃ 5 min,1個(gè)循環(huán);95 ℃ 25 s,64 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,15個(gè)循環(huán);93 ℃ 25 s,60 ℃ 35 s,72 ℃ 20 s,31個(gè)循環(huán);收集信號,觀察曲線,對檢測結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征

本研究173例PTMC患者中,男性17例(9.8%),女性156例(90.2%),年齡在17-71歲之間,平均(44.5±10.1)歲,其中≥45歲的93例(53.8%),<45歲的80例(46.2%);腫瘤直徑為0.15-1.0 cm,平均直徑為(0.65±0.21)cm,其中腫瘤直徑0.5-1.0 cm為119例(68.8%),腫瘤直徑<0.5 cm的54例(31.2%);腫瘤出現(xiàn)腺外侵犯7例(4.0%),未出現(xiàn)腫瘤腺外侵犯166例(96.0%);發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例(27.7%),未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移125例(72.3%);腫瘤分期為T1期166例(96.0%),T3期為7例(4.0%)。

2.2 BRAFV600E基因突變在PTMC中的突變情況

173例PTMC患者樣本中發(fā)生BRAFV600E基因突變?yōu)?04例,突變率為60.12%;野生型為69例(檢測擴(kuò)增曲線見圖1)。

A.突變型樣本擴(kuò)增曲線 B.野生型樣本擴(kuò)增曲線圖1 BRAFV600E基因突變檢測擴(kuò)增曲線Figure 1 Amplification curve of BRAFV600E gene mutation detection

2.3 BRAFV600E基因突變與PTMC臨床病理特征的相關(guān)性

統(tǒng)計(jì)本組研究結(jié)果顯示:BRAFV600E基因突變與PTMC患者的性別、年齡、多發(fā)病灶、甲狀腺腺外侵及、是否伴隨鈣化、腫瘤分期等臨床病理特征均無相關(guān)性(P>0.05);與患者的腫瘤直徑大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(均P<0.05,見表1)。

表1 BRAFV600E基因突變與PTMC患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

Table 1 Relationship between BRAFV600Egene mutation and clinicopathological characteristics of PTMC patients(cases)

臨床病理特征項(xiàng)目nBRAFV600E基因突變型野生型χ2P性別0.16570.6840 男17116 女1569363年齡0.00080.9770 <45歲804832 ≥45歲935637腫瘤直徑4.6890.0304 0.5-1 cm1197841 <0.5 cm542628病灶數(shù)2.30800.1287 單發(fā)1629567 多發(fā)1192鈣化0.000030.9957 是532 否16810167腺外侵及0.38940.5326 是752 否1669967淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31.34<0.0001 是48453 否1255966腫瘤T分期0.38940.5326 T11669967 T3752

3 討論

BRAF基因?qū)儆赗AF家族成員,位于人染色體的7q34,含有18個(gè)外顯子,編碼蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量約為94 kD,包含783個(gè)氨基酸殘基,屬于絲氨酸/蘇氨酸特異性激酶,是一種高效的磷酸化劑,是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK信號傳導(dǎo)通路最為關(guān)鍵的激活因子,參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件,如細(xì)胞生長、分化和凋亡等[4]。BRAF基因最常見的突變是發(fā)生在15外顯子上第1 799位核苷酸胸腺嘧啶轉(zhuǎn)化為腺嘌呤(T1799A),引起B(yǎng)RAF蛋白第600位密碼子的纈氨酸被谷氨酸替代,從而導(dǎo)致BRAF激酶激活向MAPK信號通路下游持續(xù)傳遞有絲分裂信號,造成細(xì)胞過度增殖、分化及腫瘤的形成和持續(xù)生長[5]。近幾年隨著對PTC的分子發(fā)病機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),BRAFV600E基因突變是其最常見的基因變化,目前認(rèn)為BRAFV600E基因突變與PTC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),已成為了解PTC患者預(yù)后一種重要途徑。

近年來隨著高頻彩超的廣泛應(yīng)用,PTMC的檢出率呈明顯的增長趨勢,2014年WHO公布的全球癌癥報(bào)告指出,甲狀腺癌新發(fā)病例中PTMC已經(jīng)超過50%,雖然大多數(shù)PTMC腫瘤的生物學(xué)行為傾向于良性,處于低危狀態(tài),預(yù)后良好,但是部分PTMC具有高侵襲性的臨床病理特點(diǎn),可出現(xiàn)原發(fā)灶很小就有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,甚至全身多發(fā)轉(zhuǎn)移[6]。目前對于PTMC風(fēng)險(xiǎn)評估的關(guān)鍵指標(biāo)包括高齡、男性、較大腫瘤直徑、腺外侵及、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和高級別的病理分期,但這些大多是以術(shù)后病理學(xué)檢查結(jié)果和回顧性研究為主,對術(shù)前評估及術(shù)中指導(dǎo)價(jià)值有限?，F(xiàn)階段PTMC的治療方式主要是手術(shù),預(yù)防性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃術(shù)(central lymph node dissection CLND)作為最常用的手術(shù)方式,預(yù)防性CLND雖然可清掃亞臨床轉(zhuǎn)移病灶,但同時(shí)也擴(kuò)大了手術(shù)范圍,增加了甲狀旁腺喉返神經(jīng)損傷和出血的風(fēng)險(xiǎn),臨床上對于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的PTMC患者手術(shù)治療時(shí)是否同期行預(yù)防性CLND仍存在較大爭議,如何進(jìn)行中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的術(shù)前風(fēng)險(xiǎn)評估成為臨床急需解決的問題。

現(xiàn)有研究結(jié)果顯示[7-10],在PTC患者中BRAFV600E突變型比野生型的復(fù)發(fā)率更高,BRAFV600E突變與腫瘤侵襲性特征呈正相關(guān),BRAFV600E基因突變可以用于評估PCT的危險(xiǎn)程度,在PTC患者中BRAFV600E基因突變率約為29%-88%,而在PTMC患者中BRAFV600E基因突變率則略低一些,約為15%-65.1%,本研究173例PTMC患者中發(fā)生BRAFV600E基因突變的為104例,突變率為61.12%,與現(xiàn)有報(bào)告數(shù)據(jù)較一致。多數(shù)研究表明BRAFV600E基因突變與PTC患者的腫瘤大小、腺外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤疾病分期等多項(xiàng)臨床病理特征相關(guān)[11,12],而目前關(guān)于BRAFV600E基因突變與PTMC患者的臨床病理學(xué)特征之間關(guān)系的相關(guān)報(bào)道還是相對較少,得出的結(jié)論也不盡相同,甚至有部分報(bào)道在某些結(jié)論上仍存在較大的爭議,尚未達(dá)成統(tǒng)一。本研究結(jié)果顯示BRAFV600E基因突變與PTMC患者的性別、年齡、多發(fā)病灶、甲狀腺腺外侵及、是否伴隨鈣化、腫瘤分期等臨床病理特征均無相關(guān)性(均P>0.05),這些差別可能與研究對象納入標(biāo)準(zhǔn)、樣本例數(shù)、統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)等各種因素有關(guān)。

Liu等[13]認(rèn)為腫瘤直徑≥0.5 cm時(shí),BRAFV600E基因突變率和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率更高,對于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTMC患者BRAFV600E突變是獨(dú)立的危險(xiǎn)因素,但腫瘤直徑≤5 mm者未見明確相關(guān)性。在本組研究中,腫瘤直徑>0.5 cm組BRAFV600E突變率為65.5%,明顯高于≤0.5 cm組的48.1%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),顯示腫瘤直徑越大其BRAFV600E基因突變率越高;在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的48例患者中出現(xiàn)BRAFV600E突變的為45例,突變率高達(dá)93.8%,而在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的125例患者中,BRAFV600E基因發(fā)生突變的為59例,突變率為47.2%,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的BRAFV600E基因突變率明顯高于未突變者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明發(fā)生BRAFV600E突變的腫瘤細(xì)胞可能更具有侵襲性,更容易從原發(fā)灶轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)或其他地方,BRAFV600E突變可能是導(dǎo)致PTMC早期發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移一大重要因素。Zheng等[14]和Czarniecka等[15]的報(bào)道在得到了相似結(jié)論的同時(shí),進(jìn)一步提出了BRAFV600E突變可以當(dāng)做PTMC患者淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素的觀點(diǎn)。Lang等[16]和Lee等[17]學(xué)者認(rèn)為術(shù)前分析BRAFV600E基因突變情況可為不必要的預(yù)防性CLND提供依據(jù),BRAFV600E基因存在突變的患者則建議執(zhí)行預(yù)防性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃術(shù)。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示BRAFV600E基因突變與PTMC患者的性別、年齡、多發(fā)病灶、甲狀腺腺外侵及、是否伴隨鈣化、腫瘤分期等臨床病理特征均無相關(guān)性,與腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),BRAFV600E基因突變與PTMC侵襲性的生物學(xué)行為有一定的相關(guān)性,可為術(shù)前手術(shù)選擇和預(yù)后提供一定的參考價(jià)值。但BRAFV600E基因突變能否作為PTMC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)與復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測因子仍需進(jìn)一步深入研究。