劉 棟,王建華△,高增戰(zhàn)*,劉思達(dá),段降龍,劉 斌,武 敏,毛智軍,張 濤,薛 飛,普彥淞,龍延濱

(1陜西省人民醫(yī)院普外二科,西安 710068;2陜西省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,西安 710068;△共同第一作者;*通訊作者,E-mail:gaoxi8004@163.com)

胃癌(gastric cancer,GC)的發(fā)病率逐年上升,全球的發(fā)病率占據(jù)惡性腫瘤發(fā)病率的第5位,死亡率位居惡性腫瘤第3位[1,2],死亡人數(shù)量約占全部惡性腫瘤死亡總?cè)藬?shù)的9.2%,嚴(yán)重危害人類的健康[3]。近年來多學(xué)科診療模式(multimodality therapy,MDT)在胃癌診療已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展,但MDT所診療患者病情常較為復(fù)雜,或已失去胃癌的最佳治療時機,大多數(shù)進(jìn)展期胃癌患者預(yù)后仍較差,Ⅰ期胃癌患者5年生存率為大于85%,而Ⅳ期胃癌患者的5年生存率小于15%。侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者胃癌死亡的重要因素之一[4]。有30%-50%的初診胃癌患者同時合并肝轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重影響其預(yù)后[5]。因此,深入研究胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展的分子機制,為進(jìn)展期胃癌的治療策略提供實驗依據(jù),具有重要的現(xiàn)實意義。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是涉及上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的一系列生物學(xué)程序,細(xì)胞失去極性并與鄰近細(xì)胞接觸,隨后得到間充質(zhì)樣運動表型。EMT在腫瘤的惡性表型中發(fā)揮著關(guān)鍵和復(fù)雜的作用,包括癌癥干細(xì)胞表型,耐藥性,循環(huán)腫瘤細(xì)胞和腫瘤出芽的產(chǎn)生[6]。microRNA(miRNA)是一類19-25個核苷酸大小的非編碼RNA,調(diào)節(jié)各類細(xì)胞的生長進(jìn)程,包括生長、發(fā)育、分化、代謝和凋亡等等[7]。miR-582-5p是最初鑒定的一類重要的miRNA成員,前期研究已經(jīng)證實其參與各類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,但其在不同腫瘤中的作用還存在不一致,如在直腸癌發(fā)生發(fā)展中miR-582-5p表現(xiàn)出促進(jìn)腫瘤生長,而在前列腺癌中表現(xiàn)出抑癌基因,所以有必要研究miR-582-5p在胃癌中的作用以及侵襲轉(zhuǎn)移機制[8-10]。本研究采用miR-582-5p mimics上調(diào)胃癌細(xì)胞miR-582-5p表達(dá),研究其對胃癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響,對EMT相關(guān)分子表達(dá)的影響,初步探討對胃癌轉(zhuǎn)移的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Trizol試劑、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)。miR-582-5p、U6引物、miR-582-5p mimics及Negative control(上海吉瑪生物科技有限公司);RPMI-1640、Transwell小室培養(yǎng)基(美國Corning公司);胎牛血清、OPTI-MEN(法國Gibco公司);Matrigel膠(美國BD公司)。real-time PCR試劑(日本TaKaRa公司);real-time PCR儀(日本Bio-Rad公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、AGS和胃正常上皮細(xì)胞GES-1由陜西省人民醫(yī)院實驗室長期保存。RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,采用0.25%胰蛋白酶消化、傳代,取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3 real-time PCR檢測胃癌細(xì)胞株miR-582-5p的表達(dá)量

Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行實驗,每樣取2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行reai-time PCR檢測,引物序列:miR-582-5P正向5′-GCACACATTGAAGAGGACAGAC-3′;反向:5′-TATTGAAGGGGGTTCTGGTG-3′。U6正向:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;反向:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；隨后按95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個樣本的U6作為內(nèi)參，基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計算分析。

1.4 Western blot檢測上調(diào)miR-582-5p對胃癌細(xì)胞EMT標(biāo)志性基因表達(dá)的影響

取生長至對數(shù)期的SGC-7901和AGS細(xì)胞,6孔板中每孔加入2×105個細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞生長、融合至80%左右時,收集細(xì)胞,RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,BCA蛋白濃度定量試劑盒按照操作說明進(jìn)行蛋白定量,按照30 μg蛋白上樣量進(jìn)行12% SDS-PAGE分離蛋白,采用半干式轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,脫脂牛奶封閉2 h,順序經(jīng)一抗(1 ∶100稀釋的鼠抗人Slug、Snail、vimentin、fibronectin、E-cadherin抗體)和二抗(1 ∶1 000)孵育,ECL顯色、凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像,GAPDH作為內(nèi)參,灰度分析。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將對數(shù)生長期SGC-7901和AGS細(xì)胞按照2×105個接種于6孔板,按照實驗設(shè)計分為實驗組(轉(zhuǎn)染miR-582-5p mimics)、空白對照組(轉(zhuǎn)染negative control)。用250 μl OPTI-MEN稀釋LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑5 μl,室溫下靜置5 min,再用250 μl OPTI-MEN稀釋實驗組和空白對照組5 μl,兩者混合室溫靜置20 min,每孔加入500 μl中的轉(zhuǎn)染復(fù)合液,于5% CO2、37 ℃孵育6 h,用新鮮的完全培養(yǎng)基(含血清)替換含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基,供后續(xù)實驗使用。

1.6 劃痕試驗檢測上調(diào)miR-582-5p對SGC-7901和AGS細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

將對數(shù)生長期SGC-7901和AGS細(xì)胞按照5×105個接種于6 cm培養(yǎng)皿,待細(xì)胞長滿后,用200 μl移液器槍頭劃痕,PBS沖洗3次,更換為無血清培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng),取48 h曝光顯影,測量遷移距離、計算相對遷移率,劃痕遷移率=(劃痕后即刻劃痕面積-劃痕后24 h劃痕面積)/劃痕后即刻劃痕面積×100%。

1.7 侵襲實驗檢測上調(diào)miR-582-5p對SGC-7901和AGS細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

Matrigel膠在4 ℃過夜并融化，和1640培養(yǎng)基按照1 ∶8比例稀釋，每孔50 μl包被Transwell小室底膜的上室面，室溫風(fēng)干。接種轉(zhuǎn)染48 h的AGS和SGC-7901細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個/ml，取200 μl接種于上層小室，小室加入600 μl含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h。取出Transwell小室吸除培養(yǎng)基,利用棉簽拭去Transwell小室濾膜上面的Matrigel和未穿過濾膜的AGS和SGC-7901細(xì)胞，95%酒精固定5 min，結(jié)晶紫溶液染色1 h。顯微鏡觀察并計數(shù),取平均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件,兩組間差異分別采用兩樣本t檢驗,多組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA),以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-582-5p在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

實驗采用real-time PCR檢測人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、AGS、MGC-803、BGC-823、MKN-28和正常胃上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞株miR-582-5p的表達(dá)量,結(jié)果顯示,相比正常胃上皮細(xì)胞GES-1,miR-582-5p的表達(dá)在胃癌細(xì)胞SGC-7901、AGS、MGC-803、BGC-823、MKN-28中表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05,見圖1)。為了研究miR-582-5p在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用,選取miR-582-5p相對表達(dá)較高的SGC-7901和AGS細(xì)胞用作后續(xù)實驗研究細(xì)胞株,采用轉(zhuǎn)染miR-582-5p mimics法上調(diào)miR-582-5p的表達(dá)。

與EGS比較,*P<0.05圖1 MiR-582-5p在5種胃癌細(xì)胞中的表達(dá)Figure 1 Expression of miR-582-5p in five gastric cancer cells

2.2 miR-582-5p過表達(dá)鑒定

miR-582-5p mimics轉(zhuǎn)染前實驗選中的SGC-7901和AGS細(xì)胞,real-time PCR鑒定過表達(dá)效率。SGC-7901和AGS細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-582-5p mimics后實驗組miR-582-5p表達(dá)水平顯著低于空白對照組(negative control),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05,見圖2)。

2.3 上調(diào)miR-582-5p對胃癌細(xì)胞侵襲的影響

研究miR-582-5p在胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的作用,采用Tranaswell實驗和細(xì)胞劃痕實驗研究上調(diào)miR-582-5p對SGC-7901和AGS細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示,與陰性對照組比較,轉(zhuǎn)染組的SGC-7901和AGS細(xì)胞的遷移能力明顯減弱,差異有統(tǒng)計學(xué)差異(均P<0.05,見圖3)。Tranaswell實驗結(jié)果顯示,相比陰性對照組,轉(zhuǎn)染了miR-582-5p mimics的SGC-7901和AGS細(xì)胞的侵襲能力明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，見圖4)。

與negative control比較,*P<0.05圖2 胃癌細(xì)胞株SGC-7901和AGS轉(zhuǎn)染miR-582-5p mimics后miR-582-5p的表達(dá)Figure 2 Expression of miR-582-5p in SGC-7901 and AGS cells after transfection with miR-582-5p mimics

與negative control比較,*P<0.05圖3 細(xì)胞劃痕實驗檢測上調(diào)miR-582-5p對SGC-7901細(xì)胞和AGS細(xì)胞遷移能力的影響Figure 3 The effect of up-regulation of miR-582-5p on the migratory ability by would healing assay

2.4 上調(diào)miR-582-5p對胃癌細(xì)胞EMT標(biāo)志性基因表達(dá)的影響

為了研究miR-582-5p對胃癌細(xì)胞EMT的作用,本研究采用了real-time PCR和Western blotting檢測了上調(diào)miR-582-5p對胃癌細(xì)胞EMT標(biāo)志性基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,相比對照組(negative control),轉(zhuǎn)染了miR-582-5p mimics的SGC-7901和AGS細(xì)胞中Slug、Snail、vimentin及fibronectin表達(dá)降低,E-cadherin表達(dá)升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(均P<0.05,見圖5,6)。結(jié)果提示上調(diào)miR-582-5p增加胃癌細(xì)胞EMT的作用。

與negative control比較,*P<0.05圖4 Transwell實驗研究上調(diào)miR-582-5p后胃癌SGC-7901和AGS細(xì)胞的侵襲能力 (結(jié)晶紫染色×100)Figure 4 The effect of up-regulation of miR-582-5p on the migratory ability by Transwell assay (crystal violet staining,×100)

與negative control比較,*P<0.05圖5 real-time PCR檢測上調(diào)miR-582-5p對SGC-7901和AGS細(xì)胞EMT指標(biāo)的影響Figure 5 Effect of up-regulation of miR-582-5p on levels of EMT-related genes detected by real-time PCR

2.5 阻斷Wnt/β-catenin信號通路減弱miR-582-5p對胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用

本研究采用Dickkopf-1阻斷Wnt/β-catenin信號通路后,觀察上調(diào)miR-582-5p后對細(xì)胞侵襲遷移的影響。結(jié)果顯示,Dickkopf-1減弱了上調(diào)miR-582-5p對胃癌細(xì)胞侵襲的抑制作用(均P<0.05,見圖7)。提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路可能參與到miR-582-5p對結(jié)胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的調(diào)控。

3 討論

轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌死亡率增高的原因之一。肝臟是胃癌轉(zhuǎn)移最常見的靶器官。未治療的胃癌肝轉(zhuǎn)移患者中位生存時間僅有6個月,失去切除機會的患者5年生存率低于5%。所以深入研究與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因及其致癌、侵襲信號傳導(dǎo)通路非常有必要。miRNA是真核生物中廣泛存在的一類重要的調(diào)控分子,是參與惡性腫瘤增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥等過程的關(guān)鍵基因?，F(xiàn)階段在膀胱癌的研究中,過表達(dá)miR-582-5p的膀胱癌增殖及侵襲減慢[10]。作用機制可能是miR-582-5p抑制TGF-β信號通路影響前列腺癌的侵襲和骨轉(zhuǎn)移。然而,miR-582-5p對胃癌中侵襲、轉(zhuǎn)移的機制和相關(guān)通路未見文獻(xiàn)報道。本研究上調(diào)miR-582-5p表達(dá)明顯抑制胃癌細(xì)胞侵襲、遷移能力,提示miR-582-5p可能參與胃癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

A.SGC-7901細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量 B.AGS細(xì)胞中EMT指標(biāo)蛋白表達(dá)量與negative control比較,*P<0.05圖6 Western blotting檢測上調(diào)miR-582-5p對SGC-7901和AGS細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的影響Figure 6 Effect of up-regulation of miR-582-5p on levels of EMT-related proteins by Western blotting

圖7 Dickkopf-1阻斷Wnt/β-catenin信號通路后觀察上調(diào)miR-582-5p對SGC-7901和AGS細(xì)胞侵襲的影響Figure 7 Effect of blockage of the Wnt/β-catenin pathway by Dickkopf-1 on invasive abilities of SGC-7901 and AGS cells enhanced by up-regulation of miR-582-5p

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是多種生化變化中的必需過程,包括胚胎發(fā)育,組織重塑和傷口愈合[11]。近年來的研究表明EMT在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵性的作用。許多轉(zhuǎn)移性腫瘤的侵襲前,常常伴有EMT轉(zhuǎn)換[12]。已經(jīng)有研究表明Slug、Snail、ZEB1和Twist等轉(zhuǎn)錄因子參與了EMT的調(diào)控[13]。其中,Snail基因是EMT主要的控制者,能夠明顯抑制E-cadherin的表達(dá)。而上皮性指標(biāo)E-cadherin失去作用被公認(rèn)為是EMT的標(biāo)志[14]。本研究上調(diào)miR-582-5p抑制胃癌細(xì)胞Slug、Snail、fibronectin及vimentin表達(dá)升高和E-cadherin表達(dá)降低,提示上調(diào)miR-582-5p抑制胃癌細(xì)胞EMT的作用。

近年來,已證明幾種關(guān)鍵信號通路參與腫瘤的EMT進(jìn)程,包括Wnt/β-catenin、Hedgehog、TGF-β/Smad、PI3K/Akt和Notch通路[15-17]。Wnt/β-catenin信號通路是維持胃腸道穩(wěn)定和增殖的主要信號傳導(dǎo)途徑之一[18]。Wnt信號傳導(dǎo)的異常激活參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。Wnt信號通路路徑中組分的突變及下游的β-catenin的激活,是癌癥發(fā)生的重要的標(biāo)志性分子事件[19,20]。在非小細(xì)胞肺癌中,過表達(dá)miR-582-5p通過激活Wnt/β-catenin信號通路維持干細(xì)胞特性,抑制克隆形成能力和侵襲[7]。因此,本研究探討了Wnt/β-catenin是否參與miR-582-5p對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移及EMT的調(diào)控,Dickkopf-1阻斷Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)miR-582-3p對胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用,提示上調(diào)miR-582-5p可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路抑制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移及EMT。已有學(xué)者證明在非小細(xì)胞肺癌中,miR-582-5p通過靶向抑制Axin2、DKK3和SFRP1表達(dá),促進(jìn)Wnt/b-catenin通路激活。然而,在胃癌中,miR-582-5p激活Wnt/β-catenin信號通路的具體分子機制仍有待于進(jìn)一步的研究。

遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后差的主要因素。盡管近年來,腫瘤的生物治療取得了較大的進(jìn)展,但也面臨著諸多問題,如缺乏合適的預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。本研究上調(diào)miR-582-5p抑制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移及EMT,并且得出Wnt/β-catenin信號通路可能參與其中。因此上調(diào)miR-582-5p的表達(dá),可以減緩胃癌的轉(zhuǎn)移,可能為胃癌的生物治療提供新的治療策略。