薛觀宏，羅 燕，梁小瑞，裴文剛，馬 靜，熊科文，邵永斌

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003）

潰瘍性結(jié)腸炎即非特異性潰瘍性結(jié)腸炎，是一種常見的慢性炎癥性腸道疾病，主要累及結(jié)腸黏膜和結(jié)腸黏膜下層，呈連續(xù)性非節(jié)段性分布，臨床上多表現(xiàn)為腹瀉腹痛、黏液膿血便或便秘等癥狀，經(jīng)常性發(fā)作，纏綿難退，給患者帶來很大痛苦。潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機制復(fù)雜，在臨床上除了手術(shù)以外，還未發(fā)現(xiàn)有效且方便的治療方法。

紫花地丁和白頭翁同屬清熱藥。紫花地丁具有抑菌、抗炎、抗內(nèi)毒素等功效。葉春芝[1]采用紫花地丁外敷內(nèi)服相結(jié)合治療蜂窩組織炎35 例，有效率為100%。趙麗娟[2]采用紫花地丁治療扁桃體炎。莊淑萍[3]將紫花地丁及蒲公英搗爛外敷治療腮腺炎。白頭翁具有抗菌、抗炎、抗阿米巴原蟲、抑制病原體、增強免疫功能等功效。陳旭東等[4]采用白頭翁湯合槐花散治療20 例家畜血痢，治愈率達100%。王永剛[5]采用白頭翁湯治療濕熱蘊結(jié)證，患者癥狀基本消失，臨床痊愈。閆港[6]配制中藥散劑加味馬齒莧白頭翁散，治療30 例仔豬白痢疾病，治愈率達91%。劉巖等[7]采用清熱解毒法，在五味消毒飲的基礎(chǔ)上加減治療仔豬病毒性心肌炎，治愈率為90%。由紫花地丁、黃芩、乳香等五味中藥組成的復(fù)方制劑，具有清熱宣肺、化痰止咳等功效，效果顯著。周押琴等[8]研究證實，白頭翁加味湯對治療潰瘍性結(jié)腸炎效果優(yōu)于柳氮磺胺吡啶腸溶片。然而，紫花地丁與白頭翁配伍在治療消化系統(tǒng)性疾病方面的研究較少。本試驗旨在探究紫花地丁與白頭翁配伍對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的抗炎作用及其作用機制，為今后進一步研究潰瘍性結(jié)腸炎的中藥治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 從石河子市子午路大藥房購買紫花地丁和白頭翁，干燥至恒重。紫花地丁水煎劑：取紫花地丁200 g，用10 倍體積水浸泡30 min，加熱煮沸后微沸30 min，趁熱濾取藥液；在藥渣內(nèi)繼續(xù)加入8 倍量的水，煮沸后微沸30 min，濾取藥液，合并2 次藥液加熱濃縮至400 mL。白頭翁水煎劑：取白頭翁200 g，藥液制備過程同紫花地丁水煎劑，濃縮藥液至400 mL。紫花地丁-白頭翁配伍水煎劑：分別按1:1（紫花地丁100 g，白頭翁100 g）、1:3（紫花地丁50 g，白頭翁150 g）、3:1（紫花地丁150 g，白頭翁50g）的比例稱取藥材，同前述方法制備藥液并濃縮至400 mL。將所有制備完成的藥液裝于藥液瓶內(nèi)，-4℃低溫保存?zhèn)溆谩Ｆ渌噭┌前愤拎つc溶片和右旋葡聚糖硫酸鈉。

試驗儀器包括恒溫水浴鍋（型號：HHW21.600AII，天津市泰斯特儀器有限公司）；高速冷凍離心機（型號：Mu Itifuge XLR，美國賽默飛世爾科技有限公司）；微量移液器（型號：Transferpette-s，TBRAND 德國普蘭德）；精密電子天平（型號：BS423S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)）；自動制冰機（型號：IM-50，常熟市雪科電器有限公司）。BX41TF 光學(xué)顯微鏡：OLYMPUS；病理切片機：Leica RM2245；包理機：GE 1160；攤片機：Leica HI1220。

1.2 試驗動物 SPF 級健康昆明小鼠80 只，6～8 周齡，體重18～22 g，雌雄各半。小鼠購入后飼養(yǎng)于（22±2）℃的動物房中適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后開展試驗。

1.3 試驗方法

1.3.1 造模 將適應(yīng)性喂養(yǎng)后的80 只小鼠隨機分成8 組，每組10 只，除空白對照組外，其余各組每天分別于10:00、14:00 和16:00 給予3%右旋葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液定量灌胃，每次0.6 mL/20 g 體質(zhì)量，連續(xù)7 d，建立潰瘍性結(jié)腸炎模型，空白對照組灌服蒸餾水。造模期間每天觀察小鼠飲食、毛發(fā)、一般活動狀態(tài)等，出現(xiàn)稀便、腹瀉、大便隱血或肉眼血便的任一癥狀即判定為模型建立成功，選取造模成功的小鼠平均分入各試驗組。

1.3.2 分組及給藥 試驗共分為8 組，即空白對照組、模型組、陽性對照組、紫花地丁組、白頭翁組、紫花地丁-白頭翁（1:1）組、紫花地丁-白頭翁（1:3）組、紫花地丁-白頭翁（3:1）組。按照《實驗動物和動物實驗技術(shù)》中動物給藥量計算：小鼠一日劑量=9.01×人的劑量（mg/kg）；人標準體重按60 kg 算，常規(guī)中草藥成人一日劑量按80 g計算，則小鼠一日用量為12 013 mg/kg，按上述方法計算出小鼠的一日劑量為240.26 mg（小鼠的標準體重按20 g 計算），將各中藥水煎成濃度約為0.48 g/mL 的湯劑；同法，給予小鼠一日所需柳氮磺胺吡啶腸溶片的等效劑量為450.5 mg/kg，經(jīng)研磨、溶解，配制成0.018 g/mL混懸液；空白對照組和模型組每日灌胃蒸餾水0.5 mL，陽性對照組每日灌胃柳氮磺胺吡啶腸溶片混懸液0.5 mL，各水煎劑每日灌胃0.5 mL，連續(xù)7 d。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 一般情況觀察及疾病活動指數(shù)（DAI）評分 分別于給藥第1、3、5、7 天稱小鼠體重，并取各小鼠糞便，觀察大便性狀，糞便隱血試劑盒（鄰甲苯胺法）測定大便隱血分數(shù)。根據(jù)文獻標準對小鼠DAI 進行評分，DAI=（體重下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+大便隱血分數(shù)）/3，評分標準見表1[9]。

表1 DAI 評分

1.4.2 結(jié)腸大體損傷指數(shù)（CMDI）評分 末次給藥2 h后，斷頸處死所有小鼠，剖開腹腔，取肛門至回盲部的結(jié)腸腸段，沿腸系膜緣縱行剖開，生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干多余水分并放置于白板上，放大鏡觀察各小鼠結(jié)腸的形態(tài)及大體損傷程度。評分標準見表2[10]。

表2 結(jié)腸大體損傷指數(shù)評分標準

1.4.3 結(jié)腸病理組織學(xué)指數(shù)（CHPI）評分 每只小鼠在距離肛門1 cm 處取遠端結(jié)腸組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE 染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)改變，組織學(xué)損傷程度用炎癥、病變深度、隱窩破壞與病變范圍評分的乘積表示。評分標準見表3[11]。

1.4.4 結(jié)腸髓過氧化物酶（MPO）活性的測定 取2 cm結(jié)腸中下段，加9 倍結(jié)腸質(zhì)量的生理鹽水，充分勻漿，于4 ℃、10 000 r/min 離心15 min，取上清液，按照MPO 測試盒說明書，加入相應(yīng)的試劑，進行MPO 活力測定。酶活力單位定義：每克組織濕片在37℃的反應(yīng)體系中過氧化氫被分解為1 μmol 為1 個酶活力單位。MPO 活力=測定OD 值-對照OD 值/11.3×取樣量（g）。

表3 病理組織學(xué)指數(shù)評分標準

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，結(jié)果以平均值±標準差表示，組間采用方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癥狀 造模第5～6 天后，造模小鼠出現(xiàn)腹瀉，食欲下降，被毛雜亂等癥狀；造模第6～7 天，造模小鼠出現(xiàn)不同程度肉眼可見的稀便，活動量明顯減少，處于安靜狀態(tài)。對造模組死亡的小鼠進行剖檢，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸有肉眼可見的潰瘍，造模成功。此時給小鼠分別給予不同比例配伍的紫花地丁與白頭翁水煎劑進行干預(yù)，第1 天，癥狀恢復(fù)不明顯，個別小鼠仍有軟便，隨后每天體重均有所增加，個別增加不明顯，7 d 后，小鼠腹瀉、稀便等癥狀明顯減輕。

2.2 小鼠結(jié)腸組織學(xué)改變 由圖1 可見，空白對照組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，腺體明顯，未見萎縮、壞死、變性及炎性細胞浸潤等現(xiàn)象。與空白對照組相比，模型組小鼠具有典型的潰瘍性結(jié)腸炎病理變化。結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)潰瘍，腺樣異常，不典型增生，并伴有淋巴細胞增生，嗜酸性粒細胞和中性粒細胞等炎性細胞浸潤，隱窩數(shù)量明顯減少。與模型組相比，紫花地丁-白頭翁（3:1）組，紫花地丁-白頭翁(1:3）組和紫花地丁-白頭翁（1:1）組隱窩數(shù)量均有所恢復(fù)，其中紫花地丁-白頭翁（3:1）組隱窩數(shù)量較其他組恢復(fù)明顯，隱窩炎癥減輕，炎性細胞浸潤程度輕。

2.3 各組小鼠一般情況觀察及DAI、CMDI 以及CHPI評分結(jié)果由表2 可見，DAI 評分中，與空白對照組相比，紫花地丁-白頭翁（1:3）組、紫花地丁-白頭翁（1:1）組、白頭翁組、紫花地丁組以及模型組差異顯著，模型組差異極顯著；試驗組間，紫花地丁-白頭翁（3:1）組與紫花地丁-白頭翁（1:3）組、紫花地丁-白頭翁（1:1）組以及紫花地丁組、白頭翁組差異顯著，紫花地丁-白頭翁（3:1）組和模型組之間差異極顯著。

圖1 小鼠結(jié)腸病理組織切片（HE 染色，40×10）

CMDI 評分中，與空白對照組相比，模型組差異顯著；試驗組間，紫花地丁-白頭翁（3:1）組和模型組之間差異顯著，其余各組間差異不顯著。CHPI 評分中，與空白對照組相比，紫花地丁-白頭翁（1:1）組和模型組差異顯著；紫花地丁-白頭翁（3:1）組、紫花地丁-白頭翁（1:3）組和模型組之間差異顯著。

表2 小鼠DAI、CMDI 以及CHPI 評分結(jié)果

2.4 紫花地丁-白頭翁配伍對小鼠MPO 活性的影響表3 結(jié)果顯示，未給予任何藥物治療的模型組小鼠結(jié)腸組織的MPO 活性含量顯著升高，與空白對照組相比差異極顯著。給予各比例的紫花地丁與白頭翁配伍的水煎劑后，各組小鼠結(jié)腸組織的MPO 活性均有所降低，其中紫花地丁-白頭翁（3:1）組小鼠結(jié)腸組織的MPO 活性與模型組差異極顯著。

表3 結(jié)腸MPO 活性測定結(jié)果

3 討 論

3.1 紫花地丁與白頭翁的有效成分及作用 紫花地丁的有效成分為軟脂酸、對羥基苯甲酸、反式對羥基桂皮酸、丁二酸、二十四酰對羥基苯乙胺等，具有抗菌抗炎、抗內(nèi)毒素、抗氧化等藥理作用[12]。白頭翁的有效成分為羽扇豆烷型皂苷和齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷[13]，具有抗菌、抗炎、抗阿米巴原蟲、抑制病原體、增強免疫功能等功效。實驗室前期通過體內(nèi)和體外試驗進行了紫花地丁化學(xué)成分及其抗炎活性研究，結(jié)果顯示，紫花地丁提取物具有顯著的抗炎活性（未發(fā)表），為了研究紫花地丁在臨床上的應(yīng)用，采用復(fù)方形式與白頭翁配伍，治療臨床上潰瘍性結(jié)腸炎。

3.2 造模 DSS 誘導(dǎo)動物結(jié)腸炎是潰瘍性結(jié)腸炎的動物模型，常用于結(jié)腸炎藥理作用的研究，DSS 可破壞腸黏膜屏障，導(dǎo)致黏膜組織壞死，促進DSS 在通透性增加的結(jié)腸組織中擴散，從而加重炎癥反應(yīng)。該模型的建立簡單方便，重現(xiàn)性好，便于實驗的研究與篩選[14]。本試驗以灌胃方式給予小鼠DSS 造模，造模第5～6 天后，造模小鼠出現(xiàn)腹瀉，食欲下降，被毛雜亂等癥狀；造模第6～7 天，造模小鼠出現(xiàn)不同程度肉眼可見的稀便，活動量明顯減少，精神沉郁，處于安靜狀態(tài)。

3.3 紫花地丁-白頭翁配伍對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的抗炎作用 潰瘍性結(jié)腸炎以腹痛腹瀉，粘液狀血便為主要臨床癥狀，DSS 誘導(dǎo)的小鼠表現(xiàn)精神沉郁，食欲不振，大便稀軟，體重下降。本實驗中，給予紫花地丁與白頭翁配伍的水煎劑，可緩解潰瘍性結(jié)腸炎小鼠糞便隱血程度以及疾病活動指數(shù)，紫花地丁-白頭翁(3:1) 可顯著改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血便程度及精神狀況。通過組織病理學(xué)檢查，紫花地丁-白頭翁（3:1）明顯減少結(jié)腸組織損傷范圍，減輕炎性細胞的浸潤程度，隱窩數(shù)量恢復(fù)明顯。紫花地丁-白頭翁（3:1）組與模型組的CHPI、CMDI 評分差異顯著，表明紫花地丁-白頭翁（3:1）可明顯改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的臨床表現(xiàn)。

在炎性反應(yīng)初期常伴發(fā)浸潤程度和炎性因子水平的升高，MPO 是中性粒細胞中含量較高的一種酶，該活性可反映出中性粒細胞的浸潤數(shù)目和活性，因此，常通過測量MPO 活性作為對損傷部位炎癥程度的評價指標。本試驗結(jié)果表明，DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型組小鼠MPO 活性明顯升高，顯示炎區(qū)中性粒細胞浸潤，給予紫花地丁-白頭翁（3:1）水煎劑干預(yù)后，小鼠結(jié)腸MPO 活性顯著降低，表明該配伍比例可明顯減輕DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎炎癥浸潤程度及損傷程度。

綜上，紫花地丁-白頭翁（3:1）可減輕潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的臨床癥狀，其機制可能與其抑制結(jié)腸中MPO活性有關(guān)。關(guān)于紫花地丁和白頭翁配伍治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制，還有待于進一步研究。