經(jīng)爭(zhēng)輝，婁宇飛，張夢(mèng)瑤，徐養(yǎng)濱，郭萌萌，張 科，楊雨鑫，陳玉林

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013 年我國(guó)可利用的玉米秸稈總量達(dá)2.2 億t[1]，但50%左右的玉米秸稈通過(guò)就地粉碎還田或焚燒，不僅利用效率較低，而且會(huì)造成空氣污染。近年來(lái)，玉米秸稈作為反芻動(dòng)物飼料成為新的研究趨勢(shì)，但玉米秸稈中粗纖維含量高，體積大，質(zhì)地粗硬，可利用的養(yǎng)分較少，適口性差，因此必須對(duì)其進(jìn)行加工處理，以提高消化率，降低粗纖維含量[2]。青貯便是玉米秸稈常見(jiàn)的處理方法之一。玉米秸稈青貯是在厭氧條件下利用乳酸菌產(chǎn)生有機(jī)酸使秸稈pH 下降，抑制腐敗菌生長(zhǎng)繁殖，使飼料達(dá)到長(zhǎng)期保存的一種飼料調(diào)制方法[3]。在玉米秸稈青貯過(guò)程中添加飼用復(fù)合菌劑一方面能夠加速降低發(fā)酵pH，減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失，且可顯著降低粗纖維、木聚糖等動(dòng)物難以降解的物質(zhì)，提高玉米秸稈的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；另一方面可充分利用玉米秸稈資源，減少環(huán)境污染。

國(guó)內(nèi)學(xué)者利用益生菌添加劑調(diào)制青貯飼料進(jìn)行了大量研究。王鳳林等[4]、靳會(huì)珍等[5]、權(quán)金鵬等[6]研究發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)合菌劑可以有效提高青貯玉米秸稈的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，但只關(guān)注了玉米秸稈添加復(fù)合菌劑發(fā)酵前和發(fā)酵后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的差異，沒(méi)有對(duì)青貯期間的pH 和復(fù)合菌數(shù)量的變化規(guī)律進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。本試驗(yàn)旨在探討添加復(fù)合菌劑對(duì)玉米秸稈青貯品質(zhì)的影響，并對(duì)青貯期間乳酸菌、酵母菌和pH 等指標(biāo)的變化規(guī)律進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，以期利用復(fù)合菌劑改善玉米秸稈青貯品質(zhì)，為青貯玉米秸稈制作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 菌種為實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)藏備用的優(yōu)勢(shì)菌種。3株乳酸菌分別為L(zhǎng).plantarum NBRC 15891、L.brevis ATCC14869、L.plantarum CIP 103151，菌株從山羊皺胃和青貯玉米中分離。2 株芽孢桿菌分別為B.subtilis DSM 10和B.cereus CCM 2010，菌株從青貯玉米中分離。3 株酵母菌分別為S.cerevisiae X55、S.sp.WW-W23、S.cerevisiae ySR 128，菌株從青貯玉米和青貯劑中分離。1 株黑曲霉菌為Ascomycota sp.ARIZ CVAsh-10，由西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院饋贈(zèng)。玉米秸稈取自陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)站。

1.2 菌液制備 3 株乳酸菌等比例混合接種到MRS 液體培養(yǎng)基；2 株芽孢桿菌等比例混合接種到LB 液體培養(yǎng)基；3 株酵母菌等比例混合接種到PDA 液體培養(yǎng)基；1 株黑曲霉菌接種到PDA 液體培養(yǎng)基。37℃震蕩培養(yǎng)24 h，經(jīng)測(cè)定活菌數(shù)大于1.0×108CFU/g。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分為對(duì)照組（CK）和試驗(yàn)組（G1、G2、G3），每組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，在0、3、7、14、21、28、42、60 d采樣，共計(jì)96 個(gè)樣品。其中3 個(gè)試驗(yàn)組（G1、G2 和G3 組）按照原料的干物質(zhì)重量均添加3%乳酸菌、2%酵母菌和3%黑曲霉菌液，分別添加3%、2%和1%芽孢桿菌菌液，液體復(fù)合菌的總添加量為秸稈重量的5%，CK 組不添加菌液，將等體積水均勻地噴灑在秸稈上，裝入10 kg 的密封發(fā)酵桶中。

1.4 秸稈的加工調(diào)制 在玉米乳熟期，分離玉米棒和玉米秸稈，采用玉米秸稈進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。經(jīng)測(cè)定，玉米秸稈原料中干物質(zhì)含量為26.42%，酸性洗滌纖維（ADF）含量為7.58%，中性洗滌纖維（NDF）含量為13.17%，粗蛋白質(zhì)（CP）含量為5.67%。將玉米秸稈刈割后置于鍘草機(jī)內(nèi)切成1～2 cm 小段，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)添加復(fù)合菌培養(yǎng)液后，立即裝入發(fā)酵桶中，壓實(shí)排出空氣后密封，置于常溫下發(fā)酵，每組24 個(gè)發(fā)酵桶，各組分別于0、3、7、14、21、28、42、60 d 開(kāi)啟3 個(gè)發(fā)酵桶檢測(cè)，去除發(fā)酵桶上表面5.0 cm 左右的青貯秸稈，混勻后采用四分法進(jìn)行取樣。取樣后，立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。開(kāi)封后的發(fā)酵桶不再用于后期試驗(yàn)采樣。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 青貯感官評(píng)定 按照《青貯飼料質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》[7]，開(kāi)封時(shí)對(duì)青貯玉米秸稈中的水分含量、色澤、氣味和質(zhì)地等感官指標(biāo)評(píng)定，并測(cè)定pH，進(jìn)行評(píng)分。采用百分制評(píng)分，具體評(píng)分對(duì)象為pH（25）、水分（20）、氣味（25）、色澤（20）、質(zhì)地（10），并規(guī)定100～76為優(yōu)、75～51 為良。

1.5.2 營(yíng)養(yǎng)成分 pH 采用pH 計(jì)測(cè)定。乳酸采用離子色譜儀[8]測(cè)定、揮發(fā)性脂肪酸采用氣相色譜法[9]測(cè)定。取50 g 鮮樣，置于65℃烘箱中48 h，冷卻后稱(chēng)重為干物質(zhì)含量，粉碎后盛于塑料封口袋中用于CP、NDF 和ADF 含量測(cè)定[12]。NDF 和ADF 采用范氏纖維測(cè)定法[10]測(cè)定；CP 采用凱氏定氮法[11]測(cè)定。

青貯袋開(kāi)封后稱(chēng)取5 g 樣品，裝入45 mL 無(wú)菌水中，在轉(zhuǎn)速為180 r/min 的搖床上震蕩30 min 后成為10-1的稀釋液，依次按10-3、10-5的倍數(shù)稀釋?zhuān)缓笕?0 μL 稀釋液于MRS、PDA 培養(yǎng)基上滴加，并在對(duì)應(yīng)的平板上分別均勻涂布后在37℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h，備測(cè)[13]。所用培養(yǎng)基采用本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的配方[14]：MRS培養(yǎng)基（乳酸菌）：10 g 蛋白胨、15 g 酵母提取物、20 g 葡萄糖、5 g 牛肉膏、5 g 乙酸鈉、2 g 檸檬酸三銨、2 g KH2PO4、0.25 g MnSO4、0.58 g MgSO4、l mL 吐溫-80溶于1 L 蒸餾水。PDA 培養(yǎng)基（酵母菌、黑曲霉）：30 g 蔗糖、2 g 蛋白胨、1 g NaNO3、2 g K2HPO4、0.5 g MgSO4、0.5 g KCl、0.01 g FeSO4溶于1 L 蒸餾水。LB培養(yǎng)基（芽孢桿菌）：10 g 蛋白胨、5 g 酵母提取物、10 g 氯化鈉溶于1 L 蒸餾水。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 25.0 對(duì)各項(xiàng)數(shù)據(jù)F 值進(jìn)行方差分析，差異顯著時(shí)采用LSD 方法對(duì)各組間平均數(shù)進(jìn)行多重比較，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，顯著性水平置于0.05。使用GraphPad.Prism.6.0 制作柱狀圖和趨勢(shì)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯玉米秸稈感官評(píng)定 如表1 所示，在不同的取樣時(shí)間，試驗(yàn)組的玉米秸稈青貯感官評(píng)分均高于CK 組（P＜0.05），隨著青貯時(shí)間的延長(zhǎng)，CK 組的感官評(píng)分有逐漸下降的趨勢(shì)，各試驗(yàn)組間的感官評(píng)分均差異不顯著，說(shuō)明添加復(fù)合菌可有效改善青貯玉米秸稈的感官品質(zhì)。

2.2 復(fù)合菌劑對(duì)青貯玉米秸稈干物質(zhì)含量的影響 為進(jìn)一步評(píng)定試驗(yàn)組在整個(gè)發(fā)酵期內(nèi)干物質(zhì)是否損失，測(cè)定了60 d 時(shí)青貯玉米秸稈的干物質(zhì)損失率。依據(jù)圖1 可得，G1 組與CK 組的干物質(zhì)含量差異不顯著，G2 組和G3組的干物質(zhì)顯著下降，G1、G2、G3 組干物質(zhì)損失率分別為2.2%、5.2%、4.3%，表明復(fù)合菌劑中芽孢桿菌降低會(huì)增加青貯過(guò)程中干物質(zhì)的損失。

圖1 60 d 青貯玉米秸稈的干物質(zhì)含量

2.3 玉米秸稈青貯期間pH 的變化趨勢(shì) 如圖2 所示，隨著青貯時(shí)間的延長(zhǎng)，青貯玉米秸稈的pH 整體呈下降趨勢(shì)，在前3 d 內(nèi)pH 由5.71 降低到3.66，下降了35.9%，試驗(yàn)組pH 均低 于CK 組（P＜0.05），可 能因?yàn)樘砑拥娜樗峋杆俜敝?，使得發(fā)酵飼料產(chǎn)生大量的乳酸導(dǎo)致飼料pH 迅速下降。3 d 后試驗(yàn)組pH 基本保持穩(wěn)定，均小于3.8，同時(shí)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于CK組，這表明添加復(fù)合菌劑可以有效降低青貯玉米秸稈的pH，從而延長(zhǎng)青貯飼料的保存時(shí)間，提高飼料的貯存品質(zhì)。

圖2 玉米秸稈在青貯期間pH 動(dòng)態(tài)變化

2.4 玉米秸稈青貯期間酵母菌、乳酸菌活菌數(shù)的變化趨勢(shì) 由圖3 可見(jiàn)，3 d 時(shí)試驗(yàn)組和CK 組的酵母菌數(shù)量均快速上升，試驗(yàn)組酵母菌數(shù)量分別為CK 組的2.1、1.7、2.2 倍（P＜0.05）。3 d 后隨著青貯時(shí)間的推移，各組酵母菌數(shù)量迅速下降；21 d 時(shí)對(duì)照組和試驗(yàn)組的酵母菌數(shù)量迅速下降至0，這是由于青貯飼料中產(chǎn)生大量乳酸，pH 迅速低于3.8，從而抑制酵母菌的生長(zhǎng)繁殖。

圖3 玉米秸稈青貯期間酵母菌數(shù)的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)

依據(jù)圖4 可得，與酵母菌的變化趨勢(shì)相似，在3 d 內(nèi)，各組乳酸菌數(shù)量均大幅度上升，試驗(yàn)組乳酸菌數(shù)量分別為CK 組的2.6、3.1、2.9 倍（P＜0.05），表明添加乳酸菌可以有效促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖。3～21 d 各試驗(yàn)組的乳酸菌數(shù)量逐漸下降，可能是因?yàn)樵囼?yàn)組pH 快速下降抑制了乳酸菌生長(zhǎng)。在7 d 后CK 組的乳酸菌數(shù)量逐漸下降。在60 d 時(shí)CK 組與試驗(yàn)組乳酸菌數(shù)量基本相同。

圖4 玉米秸稈青貯期間乳酸菌數(shù)的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)

2.5 復(fù)合菌劑對(duì)青貯玉米秸稈CP 含量的影響 如圖5所示，在青貯60 d 時(shí)試驗(yàn)組和CK 組相比，CP 含量分別提高了13.2%、8.9%、7.4%（P＜0.05）。這表明添加復(fù)合菌可以產(chǎn)生大量的菌體蛋白，從而提高飼料中CP 含量，從而有效提高青貯玉米秸稈的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

圖5 玉米秸稈在青貯60 d 時(shí)CP 含量

2.6 不同添加劑對(duì)青貯玉米秸稈纖維素含量的影響 依據(jù)圖6 可得，青貯60 d 時(shí)，3 個(gè)試驗(yàn)組與CK 組相比，NDF 有降低趨勢(shì)（P＞0.05），可能是添加的復(fù)合菌在厭氧酸性環(huán)境中對(duì)降解NDF 能力較弱。如圖7 所示，與CK 組相比，G1 和G3 組的ADF 分別降低14.8% 和19.4%（P＜0.05），其中G3 組降低比例最大，說(shuō)明復(fù)合菌劑中芽孢桿菌含量為1%時(shí)降解ADF 的效果較佳，各試驗(yàn)組間無(wú)顯著性差異。

圖6 玉米秸稈在青貯60 d 時(shí)NDF 含量

圖7 玉米秸稈在青貯60 d 時(shí)ADF 含量

2.7 玉米秸稈青貯期間揮發(fā)性脂肪酸的變化 由表2 可得，試驗(yàn)組和CK 組在60 d 時(shí)均無(wú)丁酸產(chǎn)生，說(shuō)明各組均可以有效抑制丁酸菌的生長(zhǎng)繁殖。試驗(yàn)組的總酸、乳酸/ 總酸含量高于CK 組（P＞0.05）。各試驗(yàn)組的乳酸含量顯著高于CK 組，特別是G3 組的乳酸含量較CK 組提高43.7%（P＜0.05），這表明添加復(fù)合菌促進(jìn)了乳酸產(chǎn)生，提高青貯玉米秸稈的品質(zhì)，這與pH 的降低結(jié)果一致。

表2 60 d 青貯秸稈的有機(jī)酸含量、各有機(jī)酸與總酸比值 %

3 討 論

青貯玉米秸稈具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。陸伊奇[15]研究表明，采食青貯玉米秸稈可以顯著提高奶牛的產(chǎn)奶量。但玉米秸稈中含有較高的粗纖維，大多數(shù)情況下玉米秸稈的青貯品質(zhì)較低。本試驗(yàn)所使用的玉米秸稈收獲時(shí)處于乳熟期，水分含量較高，干物質(zhì)含量較低，但在青貯60 d 時(shí)，試驗(yàn)組的感官評(píng)分均為優(yōu)等，說(shuō)明在高水分下添加復(fù)合菌仍可以有效抑制腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖，提高青貯玉米秸稈品質(zhì)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，G2 和G3 組與CK 組干物質(zhì)含量差異顯著，這可能是因?yàn)樵囼?yàn)組中添加的酵母菌前期大量繁殖，將玉米秸稈中的可溶性碳水化合物分解成了二氧化碳和乙醇。與CK 組相比，各試驗(yàn)組乳酸含量均顯著增加，可能是由于添加復(fù)合菌一方面增加了可分解的碳水化合物含量，促進(jìn)了乳酸發(fā)酵，另一方面復(fù)合菌中含有的乳酸菌也加快了乳酸菌繁殖速度，從而產(chǎn)生更多的乳酸[16]。青貯飼料中揮發(fā)性脂肪酸含量可以評(píng)價(jià)的飼料發(fā)酵品質(zhì)，優(yōu)質(zhì)青貯飼料的乳酸含量占有機(jī)酸總量比值較大，丁酸含量占有機(jī)酸總量比值小，或不含丁酸。發(fā)酵品質(zhì)差的青貯飼料中乳酸含量少，丁酸含量多。試驗(yàn)組和CK 組在發(fā)酵過(guò)程中均沒(méi)有產(chǎn)生丁酸，這是因?yàn)榘l(fā)酵前期pH 快速下降，抑制了丁酸菌的生長(zhǎng)繁殖，因此丁酸產(chǎn)量極少未能檢出。一般情況下，乳酸/乙酸大于3.0 被認(rèn)為是同型發(fā)酵乳酸菌發(fā)酵[17]。本試驗(yàn)中，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，各試驗(yàn)組的乳酸/乙酸均小于3.0，說(shuō)明發(fā)酵類(lèi)型為乙酸發(fā)酵型。NDF 是反映飼料質(zhì)量的最有效指標(biāo)，其含量可以估測(cè)反芻動(dòng)物日糧精粗比是否合適；ADF 的含量與飼料的飼用價(jià)值呈反比。與CK組相比，試驗(yàn)組ADF 顯著下降，NDF 有所降低，可能是因?yàn)閺?fù)合菌分泌降解NDF 的酶的能力較弱，其機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。與CK 組相比，60 d 時(shí)試驗(yàn)組CP 含量顯著提高，這是因?yàn)樘砑訌?fù)合菌抑制了梭菌、腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖，減少了CP 分解損失。

隨著青貯時(shí)間的延長(zhǎng)，pH 有整體下降的趨勢(shì)，0～3 d 大幅度下降之后逐漸穩(wěn)定，這與閆峻等[18]的研究結(jié)果一致，且CK 組與試驗(yàn)組具有相似的變化規(guī)律，這可能是因?yàn)橛衩捉斩挶砻娓街娜樗峋鷶?shù)量充足。0～3 d，各試驗(yàn)組與CK 組酵母菌和乳酸菌迅速繁殖，3 d 時(shí)均達(dá)到峰值，且各試驗(yàn)組的乳酸菌和酵母菌數(shù)量與CK 組相比成倍增加。3 d 后各組酵母菌數(shù)量整體呈下降趨勢(shì)，酵母菌數(shù)量在21 d 時(shí)降至105/g 以下，這是由pH 快速下降引起的。試驗(yàn)組的乳酸菌數(shù)量在21 d 后小幅度上升，隨后下降，而CK 組的乳酸菌數(shù)量3 d 后一直保持下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)閺?fù)合菌劑中含有耐酸的菌種。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，添加復(fù)合菌劑青貯玉米秸稈能夠顯著提升飼料的感官品質(zhì)，提高CP 和乳酸含量，顯著降低ADF 含量，快速降低pH。在本試驗(yàn)條件下，當(dāng)乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌和黑曲霉的添加比例為3%、2%、3%和3%時(shí)青貯玉米秸稈效果最為理想。