張 繼，吳 雪，邱淦遠，劉鵬程，楊茂林，劉若余*

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州省江口縣科技局，貴州銅仁 554400）

解耦聯(lián)蛋白基因（Uncoupling Protein，UCPs）家族的主要功能是氧化磷酸化的解耦聯(lián)作用，作為線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子載體，它可以將H+從外膜轉(zhuǎn)運到內(nèi)膜，降低H+在氧化過程中所產(chǎn)生的膜內(nèi)外的電化學(xué)梯度，從而使呼吸鏈與ATP 合成過程解耦聯(lián)，進而使氧化磷酸化合成ATP 的效率下降，能量以熱能形式散發(fā)[1-2]。UCP2（Uncoupling Protein 2）是線粒體內(nèi)膜上的一種蛋白質(zhì)，是UCPs 家族中的一員，是生物能量代謝及功能調(diào)節(jié)的重要分子[3]。UCP2 具有“質(zhì)子漏”功能[4-5]。Ricquier[6]研究表明UCP2基因在動物腦、肌肉、白色脂肪等組織中大量存在。已有研究證實UCP2基因與機體脂肪沉積有顯著關(guān)聯(lián)性[7-8]。如戶國等[9]和趙文明等[10]的研究分別證明了UCP 基因上的SNPs 位點與肉雞腹脂率和雪山雞肌內(nèi)脂肪酸含量存在一定關(guān)系。李曉燕等[11]研究表明，UCP2基因的表達與大鼠血清游離脂肪酸濃度呈正相關(guān)，與ATP 含量呈負相關(guān)，提示UCP2基因可能參與了疲勞運動中心的肌肉能量代謝。因此，很多研究者認為UCP 基因是影響牲畜和家禽生長和肉品質(zhì)特征的候選基因[12-15]。

故本研究選擇UCP2基因為候選基因，測定江口蘿卜豬11 項主要肉品質(zhì)指標，并提取背最長肌中的基因組DNA 和總RNA，構(gòu)建DNA 池后直接測序篩選SNP位點，單個樣本測序驗證后進行分型，研究不同基因型豬肉質(zhì)差異；熒光定量PCR 檢測UCP2基因在江口蘿卜豬背最長肌中的表達量，研究不同基因型豬表達量差異和表達量與肉品質(zhì)性狀間的相關(guān)性。以期篩選到良好的分子標記以輔助江口蘿卜豬的選種選育，為更好的開發(fā)利用江口蘿卜豬這一地方品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗豬由貴州省銅仁市江口縣江口蘿卜豬繁育中心提供。選擇10～12 月齡江口蘿卜豬144 頭，平均宰前體重70 kg，平均瘦肉率41%。屠宰后取部分背最長肌、腰大肌用于測定其肉品質(zhì)及DNA 提取，另取部分背最長肌組織于預(yù)裝凍存液的凍存管中保存，用于提取RNA。

1.2 主要儀器與試劑 數(shù)顯肌肉嫩度測定儀（C-LM3B，北京天翔飛域）、胴體PH 測定儀（PH-STAR，德國，Matthaus）、胴體肉色測定儀（OPTO-STAR，德國，Matthaus）、實時熒光定量PCR 儀（CFX96 Real-Time System 美國Bio-Rad），肉質(zhì)品質(zhì)分析儀（series3000，澳大利亞，NI）。

瓊脂糖（Agrose，上海生工）、2×Taq MasterMix（康為世紀）、TRIzol（RNAiso Plus 日本 TaKaRa）、RevertAid First Strand cDNA Synthesis（K1622 美國 Thermo Fisher Scientific）、iTaq Universal SYBR Green Supermix（美國 Bio-Rad）

1.3 肉品質(zhì)測定 以《豬肌肉品質(zhì)測定技術(shù)規(guī)范》（NY/T 821-2004）為標準測定剪切力、熟肉率、大理石紋、滴水損失等指標。肉色以O(shè)pto 值表示，Opto 值參考標準：Opto≥63 為優(yōu)，即肉品質(zhì)好；53≤Opto＜63 為良，即較滿意；Opto≤53 為差，即肉品質(zhì)有缺陷（PSE 肉）[16]。粗蛋白質(zhì)、水分、肌內(nèi)脂肪含量用肉品質(zhì)分析儀測定，使用之前用索氏抽提法測定5 個樣本校正。

1.4 DNA 池構(gòu)建、RNA 提取及cDNA 第1 鏈合成 利用生工生物公司的Ezup 柱式動物基因組 DNA 抽提試劑盒提取肌肉組織中的基因組DNA，DNA 濃度和純度使用紫外分光光度計測量，并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測有無降解。然后將所有樣本DNA 濃度調(diào)整相同至100 ng/μL，然后各取5 μL 混合，構(gòu)建DNA 池。采用TRIzol 法提取江口蘿卜豬背最長肌的總RNA，將所得RNA 濃度調(diào)整至500 ng/μL，用賽默飛公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（K1622）進行cDNA 合成，得到的cDNA 置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物設(shè)計與PCR 擴增 參考NCBI 上豬UCP2基因DNA 參考序列（GenBank 登錄號：NC_010451.4）和mRNA 參考序列（GenBank 登錄號：NM_214289.1）以及豬內(nèi)參基因β-actin，設(shè)計5 對引物用于擴增UCP2基因全部7 個外顯子，另外設(shè)計1 對qPCR 引物用于檢測基因表達量，并送由上海生工生物工程有限公司合成。引物擴增片段長度及最適退火溫度見表1。PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，DNA 模板2 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各2 μL、ddH2O 4 μL。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，35 個循環(huán)后再72℃終止延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增效果。熒光定量PCR 反應(yīng)體系（10 μL）：2×iTaq Universal SYBR Green Supermix 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL（將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 稀釋10 倍），無RNA 酶去離子水3 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性5 s，60.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 個循環(huán)；延伸完成后采集熒光信號。循環(huán)結(jié)束后進行熔解曲線分析：95℃ 10 s，60℃ 15 s，然后以每5 s 上升0.5℃的速率從60℃升高到95℃，每個樣品做3 個重復(fù)。

1.6 統(tǒng)計分析 對混池測序篩選到的SNP 位點進行基因分型，并以單個樣本DNA 為模板直接測序驗證，統(tǒng)計不同基因型個體。利用Pop Gene32 軟件計算群體遺傳參數(shù)，包括基因純合度（Ho）、基因雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）、多態(tài)信息含量（PIC）以及Hardy-Weinberg 平 衡 的χ2適 合 性 檢 驗。運 用SHEsis（http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php）在線軟件進行連鎖不平衡分析。利用SPSS 18.0 中的單因素方差分析對不同基因型個體肉品質(zhì)性狀進行差異顯著性分析，結(jié)果用平均值±標準差表示。利用2-△△Ct法計算基因的相對表達量，研究不同基因型個體表達量差異，并用軟件中雙變量相關(guān)性分析研究基因表達量與肉品質(zhì)性狀之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴增結(jié)果 以基因組DNA 為模板擴增UCP2基因全部外顯子序列，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 為模板，擴增UCP2基因和內(nèi)參基因引物對應(yīng)目的片段，分別取4 μL PCR 擴增后的產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增圖譜如圖1。條帶明亮、單一、整齊，無拖尾，說明基因引物特異性較好。擴增片段大小與實驗預(yù)期引物設(shè)計目的片段大小一致。

表1 UCP2 基因引物序列、退火溫度及片段長度

圖1 UCP2 基因的PCR 擴增電泳圖

2.2 PCR 測序分型 如圖2 所示，在所有外顯子序列中共篩選到3 個多態(tài)位點，以豬UCP2基因參考序列第1 外顯子第1 位堿基位為+1，則這3 個位點分別為UCP2-T5728G、UCP2-T5774G、UCP2-C5878T，均在3′UTR 區(qū)。分別以每個江口蘿卜豬DNA 為模板PCR擴增多態(tài)位點對應(yīng)的外顯子序列，然后測序驗證多態(tài)位點（圖3）。3 個多態(tài)位點均發(fā)現(xiàn)3 種基因型，并將與參考序列的相同的基因型個體定義為野生型，將不同于參考序列的純合型個體定義為突變型，雜合個體定義為雜合型。

圖2 混池測序結(jié)果

圖3 單個樣本測序結(jié)果

2.3 群體遺傳參數(shù)分析 如表2 所示，等位基因頻率差異均較大，優(yōu)勢等位基因頻率明顯高于其他等位基因，He 不高，Ne 較低，表明群體內(nèi)變異程度較低，等位基因分布不均勻，PIC 均為中度多態(tài)，能提供的一定的遺傳信息。χ2檢驗UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G 位點處于Hardy-Weinberg 平衡，UCP2-C5878T 位點顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡。

2.4 連鎖不平衡分析 如表3 和圖4 所示，3 個位點之間存在連鎖不平衡，且UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G 位點為完全連鎖不平衡。

表3 江口蘿卜豬UCP2 基因SNPs 位點連鎖不平衡分析

圖4 UCP2 基因D′值和r2 值連鎖圖

2.5 不同基因型個體肉質(zhì)差異分析 如表4 所示，對于UCP2-T5728G 位點和UCP2-T5774G 位點，3 個基因型間只有大理石紋差異顯著，均為TT 型個體大理石紋評分顯著高于TG 型個體。UCP2-C5878T 位點主要對剪切力有影響，3 種基因型個體剪切力差異達顯著水平，其中野生型TT 型個體剪切力顯著低于CC 型和CT 型。整體來看，UCP2基因上的SNPs 位點不同基因型個體主要在大理石紋和剪切力2 項指標中差異顯著，其中雜合型個體大理石紋均為最低，剪切力均為最高。從肌內(nèi)脂肪含量看，所有位點也均為雜合型含量最低。這一結(jié)果暗示UCP2基因可能在肌內(nèi)脂肪沉積過程中起重要作用。

2.6 不同基因型個體UCP2基因表達量差異分析 如圖5 所示，UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G 位點為雜合型表達量顯著高于野生型和突變型，UCP2-C5878T 位點為雜合型和野生型表達量顯著高于突變型。

表4 UCP2 基因不同基因型個體的肉質(zhì)差異

圖5 UCP2 基因不同基因型個體表達量

2.7UCP2基因表達量與肉質(zhì)指標相關(guān)性分析 由表5可知，江口蘿卜豬UCP2基因的表達量與pH1、失水率、滴水損失、剪切力、水份含量呈正相關(guān)，其中與剪切力呈極顯著正相關(guān)；與pH24、肉色、大理石紋、熟肉率、肌內(nèi)脂肪含量以及粗蛋白質(zhì)含量呈負相關(guān)，其中與大理石紋和肌內(nèi)脂肪含量呈極顯著負相關(guān)?？梢奤CP2基因的表達量主要與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)，在一定范圍內(nèi)，UCP2基因表達量升高，肌內(nèi)脂肪含量下降，大理石紋評分也隨之下降，剪切力則隨之升高，肉品質(zhì)下降。

表5 UCP2 基因表達量與肉品質(zhì)相關(guān)性分析

3 討 論

UCP2基因作為解耦聯(lián)蛋白家族的成員，在能量代謝中扮演著重要的角色，其與脂肪的沉積密切相關(guān)，UCP2基因變異很有可能會影響畜禽的生長性能和肉品質(zhì)，國內(nèi)外已有很多研究證實了這一推測。如蔣秋斐等[17]發(fā)現(xiàn)，UCP3 不同基因型西門塔爾牛個體生長性狀之間存在顯著或極顯著差異；張娟等[18]研究發(fā)現(xiàn)，黑安格斯牛UCP3 基因多態(tài)位點不同基因型個體管圍和體重存在顯著差異；陳翠等[19]研究發(fā)現(xiàn)，UCP2基因SNPs 位點與飼料轉(zhuǎn)化效率顯著相關(guān)。本在UCP2基因上共篩選到3 個SNPs 位點，3 個位點均位于3′UTR，均不同于之前研究者所發(fā)現(xiàn)的位點。各位點普遍存在等位基因頻率差異較大，優(yōu)勢等位基因頻率明顯高于其他等位基因，He 不高，Ne 較低表明群體內(nèi)變異程度較低，可能是由于長期的人共選育或基因漂變造成的。連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G 位點為完全連鎖不平衡。在基因型與肉品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析中發(fā)現(xiàn)，UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G 位點野生型大理石紋評分顯著高于雜合型，UCP2-C5878T 位點突變型剪切力顯著低于雜合型和野生型，而且對比不同基因型個體背最長肌肌內(nèi)脂肪含量，雖差異不顯著，但也可以得到類似結(jié)果，說明UCP2基因上的SNPs 位點主要與肌內(nèi)脂肪的沉積有關(guān)系，這與劉文超[20]發(fā)現(xiàn)UCP2基因上的SNPs 位點與家兔肉品質(zhì)指標中的pH24極顯著相關(guān)的研究結(jié)果不同，可能是因為物種差異所致，但UCP2基因多態(tài)性與豬的肉品質(zhì)性能相關(guān)性尚未有研究報道。本實驗中，在不同基因型個體背最長肌UCP2基因表達量的研究中發(fā)現(xiàn)，UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G 位點為雜合型表達量顯著高于野生型和突變型，UCP2-C5878T 位點為雜合型和野生型表達量顯著高于突變型。UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G 位點因為完全連鎖，所以共同調(diào)控UCP2基因的表達，但為何在背最長肌中為雜合型表達量顯著高于野生型與突變型，筆者猜想144 頭江口蘿卜豬雖是同一群體，但其中來源、類型不同，會發(fā)生不同類型間的雜交，產(chǎn)生雜合效應(yīng)，使表達量增加，但具體調(diào)節(jié)機制有待進一步研究。而UCP2-C5878T 位點突變后，基因純合時，會極顯著降低UCP2基因在背最長肌中的表達量，說明UCP2-C5878T 位點的突變對UCP2基因的表達有不良影響。本研究發(fā)現(xiàn)UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G 位點雜合型個體UCP2基因高表達，但是其大理石紋評分顯著低于野生型和突變型，肉品質(zhì)表現(xiàn)較差；UCP2-C5878T位點突變型UCP2基因表達量極顯著低于野生型和雜合型，其剪切力也顯著低于野生型和雜合型，肉品質(zhì)表現(xiàn)較好。而且從肌內(nèi)脂肪含量來看，也可以看出UCP2基因表達量高的基因型肌內(nèi)脂肪含量低，肉品質(zhì)差。因此，本研究認為UCP2基因的高表達不利于肌內(nèi)脂肪的沉積，對肉品質(zhì)有消極影響。最后，UCP2基因表達量與肉品質(zhì)指標相關(guān)性分析結(jié)果驗證了這一猜想，UCP2基因表達量與大理石紋評分和肌內(nèi)脂肪含量呈極顯著負相關(guān)，與剪切力呈極顯著正相關(guān)?？梢缘贸鼋Y(jié)論，UCP2基因表達量的增加不利于肌內(nèi)脂肪的沉積，會導(dǎo)致肉品質(zhì)變差。UCP2基因高表達對肌內(nèi)脂肪沉積起消極作用可能與其生理功能相關(guān)，因其介導(dǎo)的氧化磷酸化解耦聯(lián)作用，增加了脂肪酸的氧化分解供能，不利于肌內(nèi)脂肪的沉積。但是由于豬屬于中大型動物，很難做到大批同質(zhì)個體的屠宰測定，而且畜禽肉品質(zhì)受到多種基因調(diào)控，本研究結(jié)果還有待今后進一步擴大樣本容量驗證。

4 結(jié) 論

本研究在江口蘿卜豬UCP2基因上篩選到3 個SNPs 位點，分別為UCP2-T5728G、UCP2-T5774G 和UCP2-C5878T，發(fā)現(xiàn)UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G位點野生型大理石紋評分顯著高于雜合型，UCP2-C5878T 位點突變型剪切力顯著低于雜合型和野生型；UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G 位點為雜合型表達量顯著高于野生型和突變型，UCP2-C5878T 位點為雜合型和野生型表達量顯著高于突變型；UCP2基因表達量與大理石紋評分和肌內(nèi)脂肪含量呈極顯著負相關(guān)，與剪切力呈極顯著正相關(guān)。研究結(jié)果表明，UCP2基因表達量的增加不利于肌內(nèi)脂肪的沉積，會導(dǎo)致肉品質(zhì)變差。