白建民 高菲 胡泊 時偉紅

(南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 南陽 473061)

黃芪為豆科植物黃芪的干燥根部，黃芪甲苷為中藥黃芪的主要活性成分，其化學(xué)分子式為C41H68O14〔1〕。黃芪甲苷具有廣泛的藥理活性，特別是抗糖尿病及神經(jīng)保護作用尤為突出〔2〕。黃芪甲苷可通過抗炎、抗氧化、抗凋亡等途徑保護神經(jīng)損傷〔3〕。氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡、氧自由基生成過多導(dǎo)致體內(nèi)組織或細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷，其中自由基過多產(chǎn)生是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷的關(guān)鍵〔4〕。但黃芪甲苷發(fā)揮神經(jīng)保護作用的具體機制尚未完全清楚。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，可通過激活其離子型受體產(chǎn)生興奮性毒性，也可抑制細(xì)胞膜上谷氨酸/胱氨酸逆轉(zhuǎn)運子的功能導(dǎo)致氧化性神經(jīng)損傷，以細(xì)胞內(nèi)活性氧成分升高為主要特征〔5〕。氨基端激酶(JNK)信號通路被認(rèn)為是介導(dǎo)細(xì)胞損傷的重要通路,眾多細(xì)胞死亡的誘因如氧化應(yīng)激、炎癥介質(zhì)均以激活JNK為共同通路〔6〕。但其在糖尿病視網(wǎng)膜病中作用機制尚未完全清楚。本研究觀察黃芪甲苷對人視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGC-5增殖、凋亡的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1材料 人視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGC-5購自ATCC；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、噻唑藍(lán)(MTT)、胰蛋白酶均購自美國Sellect公司；LipofectamineTM2000、聚氰基丙烯酰正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連Takara公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏診斷有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)試劑盒、ECL發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液均購自碧云天生物技術(shù)公司；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；谷氨酸(Glu)含量檢測試劑盒均購自上海晶抗公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGC-5，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞處理及分組 將對數(shù)生長期RGC-5細(xì)胞隨機分成5組，正常組：不做任何處理的常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞；高糖組：用50 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)24、48、72 h；高糖+黃芪甲苷1組：用50 mmol/L葡萄糖和25 μmol/L黃芪甲苷的培養(yǎng)液培養(yǎng)24、48、72 h；高糖+黃芪甲苷2組：用50 mmol/L葡萄糖和25 μmol/L黃芪甲苷的培養(yǎng)液培養(yǎng)24、48、72 h；高糖+黃芪甲苷3組：用50 mmol/L葡萄糖和100 μmol/L黃芪甲苷的培養(yǎng)液培養(yǎng)24、48、72 h。收集各組培養(yǎng)的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.4MTT實驗 取適量1.3各組細(xì)胞，加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，培養(yǎng)4 h，然后棄去上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩，使結(jié)晶溶解，在490 nm波長下檢測細(xì)胞吸光度(A)。細(xì)胞的增殖力與吸光值呈正比。細(xì)胞抑制率=1-A490樣品/A490對照。

1.5Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù) 將1.3各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用結(jié)合緩沖液 500 μl懸浮細(xì)胞，分別加入5 μl Annexin V-/FITC和PI，混勻，室溫避光靜置15 min。采用流式細(xì)胞儀測定結(jié)果。細(xì)胞凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。每個樣品重復(fù)3次。

1.6Western印跡 取適量對數(shù)生長期1.3各組細(xì)胞，RIPA裂解后用BCA進行定量，變性離心后取上清進行蛋白上樣。按照Western印跡實驗常規(guī)操作流程進行電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-顯影曝光。Image J分析目的條帶灰度值，以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)。

1.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 取1.3各組細(xì)胞，按照SOD試劑盒、MDA檢測試劑盒、Glu含量檢測試劑盒說明書要求進行檢測。

1.8數(shù)據(jù)處理 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度黃芪甲苷對高糖誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞活力的影響 與正常組相比，高糖組RGC-5細(xì)胞在24、48、72 h時細(xì)胞活力均顯著降低(P<0.05)，與高糖組相比，高糖+黃芪甲苷1、2、3組均顯著升高(P<0.05)；且高糖+黃芪甲苷1組顯著低于高糖+黃芪甲苷2、3組(P<0.05)，見表1。RGC-5在48 h對黃芪甲苷的濃度變化最敏感，故后續(xù)實驗選用48 h。

表1 不同濃度黃芪甲苷對高糖誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞活力的影響

1)與正常組、2)與高糖組、3)與高糖+黃芪甲苷1組比較:均P<0.05；下表同

2.2不同濃度黃芪甲苷對高糖誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞凋亡的影響 與正常組相比，高糖組RGC-5細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，與高糖組相比，高糖+黃芪甲苷1、2、3組均顯著降低(P<0.05)，且高糖+黃芪甲苷1組顯著高于高糖+黃芪甲苷2、3、組(P<0.05)。見表2。

2.3各組Caspase-3蛋白比較 與正常組相比，高糖組RGC-5細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與高糖組相比，高糖+黃芪甲苷1、2、3組均顯著降低(P<0.05)，且高糖+黃芪甲苷1組顯著高于高糖+黃芪甲苷2、3組(P<0.05)，見表2，圖1。

2.4各組SOD和MDA水平比較 與正常組相比，高糖組RGC-5細(xì)胞SOD含量顯著降低，MDA含量顯著升高(P<0.05)；與高糖組相比，高糖+黃芪甲苷1、2、3組SOD含量顯著升高，MDA含量顯著降低(P<0.05)，且高糖+黃芪甲苷1組SOD含量顯著低于高糖+黃芪甲苷2、3組，MDA含量顯著高于高糖+黃芪甲苷2、3組(P<0.05)。見表2。

2.5各組Glu含量比較 與正常組相比，高糖組RGC-5細(xì)胞Glu含量顯著升高(P<0.05)，與高糖組相比，高糖+黃芪甲苷1、2、3組顯著降低，且高糖+黃芪甲苷1組顯著高于高糖+黃芪甲苷2、3組(P<0.05)。見表2。

表2 不同濃度黃芪甲苷對高糖誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞凋亡、Caspase-3蛋白、SOD和MDA水平及Glu釋放的影響

2.6黃芪甲苷通過JNK通路抑制高糖誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞的損傷 與正常組相比，高糖組p-JNK蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，高糖+黃芪甲苷1、2、3組p-JNK蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與高糖+黃芪甲苷1組相比，高糖+黃芪甲苷2、3組p-JNK蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。各組JNK蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1，表3。

1～5：正常組，高糖組，高糖+黃芪甲苷1組，高糖+黃芪甲苷2組，高糖+黃芪甲苷3組圖1 檢測RGC-5細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)

組別p-JNK蛋白JNK蛋白正常組0.23±0.030.82±0.07高糖組0.51±0.051)0.76±0.08高糖+黃芪甲苷1組0.41±0.042)0.83±0.06高糖+黃芪甲苷2組0.31±0.032)3)0.80±0.09高糖+黃芪甲苷3組0.33±0.042)3)0.84±0.08F/P值22.640/0.0000.510/0.730

3 討 論

黃芪甲苷是黃芪的主要活性化合物，具有強大的抗氧化活性和對周圍神經(jīng)病變進展的保護作用〔7,8〕。Ding等〔9〕發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷作為視網(wǎng)膜醛糖還原酶抑制劑，可阻止細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化和失活核因子(NF)-κB信號通路，以減輕db/db小鼠糖尿病視網(wǎng)膜病中的RGCs功能障礙。Hao等〔10〕用過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能夠增加細(xì)胞存活率并降低凋亡，降低H2O2誘導(dǎo)的活性氧水平，抑制H2O2誘導(dǎo)的線粒體膜電位降低，降低H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞色素c釋放，抑制Bax和Caspase-3的表達(dá)，增加Bcl-2的表達(dá)，提示黃芪甲苷對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激具有潛在的保護作用。郝明等〔11〕發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷處理的高葡萄糖誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞可明顯增加細(xì)胞存活率，部分抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提高線粒體膜電位，減輕線粒體腫脹，提示黃芪甲苷可以保護RGC-5細(xì)胞免受高葡萄糖誘導(dǎo)的損傷，使糖尿病視網(wǎng)膜病患者受益。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可促進細(xì)胞增殖，抑制凋亡，降低Glu的興奮毒性及失活JNK信號通路。

JNK信號傳導(dǎo)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的一個組成部分，其經(jīng)典靶標(biāo)即轉(zhuǎn)錄因子JUN已被證明可調(diào)節(jié)與視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性病變相關(guān)的多種生物學(xué)過程,尤其是糖尿病視網(wǎng)膜病〔12～15〕。Kim等〔16〕闡明，JNK信號通路可作為治療視網(wǎng)膜疾病的潛在治療靶點。Lv等〔17〕研究報道，中藥葛根素可保護天冬氨酸(NMDA)誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷，可降低ROS和MAD水平，促進SOD和NO的產(chǎn)生，并下調(diào)RGCs中nNOS和iNOS的表達(dá)，其機制可能為葛根素抑制Bax、Caspase-3的表達(dá)，抑制JNK和p38磷酸化，提示葛根素可通過JNK/p38 MAPK途徑保護NMDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和RGCs損傷。